Анализ жирнокислотных профилей микронутриентных и фармацевтических препаратов на основе экстрактов омега-3 полиненасыщенных жирных кислот из природных источников

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ω3-ПНЖК) – эссенциальный (жизненно необходимый) микронутриент [1][2], участвующий в биосинтезе эйкозаноидов и докозаноидов (молекул – регуляторов воспаления) – нейропротектинов, резолвинов и маресинов [3][4]. Такие ω3-ПНЖК, как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и докозагексаеновая кислота (ДГК), принципиально необходимы для терапии и профилактики ишемической болезни сердца [1], для нейрорегенерации [4], прегравидарной подготовки [3][5]. Глубокий дефицит ω3-ПНЖК у жителей России [6] обусловливает необходимость применения специальных средств и препаратов для его компенсации. Эффективность и безопасность препаратов ω3-ПНЖК принципиально определяется качеством очистки экстрактов, содержанием полезных ω3-ПНЖК (ЭПК, ДГК и др.).

Менее стандартизированные (с фармацевтической точки зрения) препараты на основе ω3-ПНЖК часто содержат нежелательные примеси насыщенных жирных кислот (НЖК). Это класс жирных кислот без двойных связей между атомами углерода в углеродной цепи. Данная особенность структуры повышает термостабильность НЖК по сравнению с ПНЖК, способствуя росту их устойчивости к окислению, снижению антиоксидантных свойств и полезной биологической активности [7]. Известно, что профили жирнокислотного состава препаратов и нутриентных препаратов на основе ω3-ПНЖК включают более 30 различных жирных кислот: пальмитиновую (C16:0), стеариновую (C18:0), миристиновую (C14:0), лауриновую (C12:0), каприновую (C10:0), каприловую (C8:0), капроновую (C6:0) [8]. Присутствие НЖК может оказывать неблагоприятное влияние на липидный профиль крови – прежде всего, повышая атерогенность (что в той или иной степени характерно для всех НЖК) и усиливая процессы воспаления.

Например, пальмитиновая НЖК известна своей способностью повышать уровень общего холестерина, липопротеинов низкой плотности, активировать провоспалительные процессы (посредством активации толл-подобных рецепторов 4, продукции провоспалительных цитокинов интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли альфа). Кроме того, пальмитиновая кислота может усиливать экспрессию белка CD36, способствующего накоплению липидов в макрофагах и формированию пенистых клеток – ключевых участников атеросклеротического процесса [8][9].

Хотя стеариновая кислота считается менее атерогенной, чем пальмитиновая (в частности, потому, что метаболизируется в организме до мононенасыщенной олеиновой кислоты, C18:1), ее избыток уменьшает текучесть клеточных мембран. И стеариновая, и пальмитиновая НЖК способствуют развитию инсулинорезистентности [7]. Миристиновая и лауриновая кислоты обладают выраженным гиперхолестеринемическим эффектом, вызывая эндотелиальную дисфункцию и воспаление сосудистой стенки [8].

Поскольку баланс между различными типами жирных кислот играет ключевую роль в регуляции липидного обмена, важно контролировать состав препаратов ω3-ПНЖК и выбирать продукты с низким уровнем насыщенных жиров. Производители препаратов ω3-ПНЖК стремятся минимизировать содержание примесных жирных кислот (прежде всего, НЖК) посредством дистилляции и других методов очистки. Это указывает на необходимость стандартизации состава препаратов на основе ω3-ПНЖК [8][9].

Для количественного анализа жирнокислотного состава препаратов на основе ω3-ПНЖК используются различные физико-химические методы: газовая хроматография с детектором ионизации в пламени, характеризующаяся высокой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью результатов измерений [10], Фурье-преобразовательная рамановская спектроскопия (неразрушающий подход к оценке качества препаратов ω3-ПНЖК) [11], спектроскопия ядерного магнитного резонанса на основе изотопов ¹H и ¹³C [12], инфракрасная спектроскопия с преобразованием разложения Фурье для экспресс-анализа липидных компонентов и оценки степени перекисного окисления [13] и масс-спектрометрия в сочетании с жидкостной или газовой хроматографией, которая позволяет не только идентифицировать жирные кислоты, но и анализировать оксидативные метаболиты, такие как гидроксилированные и эпоксидированные производные ЭПК и ДГК [13][14].

В нашем предыдущем исследовании состава экстрактов ω3-ПНЖК из жира рыб на основе хроматографического и масс-спектрометрического анализа были получены количественные критерии для различения стандартизированных экстрактов [15]. В настоящей работе представлены результаты количественного хроматографического анализа 16 препаратов омега-3 ПНЖК.

Цель – провести анализ жирнокислотного состава микронутриентных и фармацевтических препаратов ω3-ПНЖК.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Препараты / Preparations

Препараты, исследованные в настоящей работе, представлены в таблице 1. Большинство из них изготавливались на основе сырья, включающего жир тех или иных сортов рыбы.

Хроматографическое определение жирнокислотного состава / Chromatographic determination of fatty acid composition

Как и в работе [15], образцы препаратов, приведенных в таблице 1, растворяли в гексане и подвергали солянокислому гидролизу в присутствии метанола (Methanolic-HCl (3N) Supelco^®) с последующей разгонкой на хроматографе Shimadsu GCMS-QP2010 Ultra^® с масс-спектрометрической ловушкой. В результате измерений каждый препарат описывался вектором из 55 компонент, перечисленных в таблице 2.

Для характеристики состава каждого из исследованных препаратов ω3-ПНЖК использовался профиль, включающий все 55 соединений. Помимо отдельных соединений на основе их уровней и химических типов (представлены в правой колонке таблицы 2) для характеризации каждого из исследованных образцов были рассчитаны суммарные характеристики жирнокислотного состава: общие содержания ω3-, ω6-, ω7-, ω9-, ω11-ПНЖК, ЭПК, ДГК, ЭПК+ДГК, других ω3, НЖК. Как и в работе [15], мы применяли коэффициент стандартизации (КСТ), оценивающий соответствие реально измеренных уровней ω3-ПНЖК содержанию, заявленному производителем. КСТ рассчитывается как композиция четырех компонент.

Другие методы анализа / Other methods of analysis

Для стандартной обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверку статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Помимо стандартных методов статистики в ходе анализа данных скрининга применялись новые математические подходы к интеллектуальному анализу данных, основанные на методе метрических сгущений [15], метрических конфигураций [16–18], метрических карт (проекций метрических конфигураций на плоскость), с использованием новейших алгоритмов поиска сгущений (алгоритмов кластеризации) [19][20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Хроматограммы / Chromatograms

В результате проведения экспериментов были получены хроматограммы для каждого из 16 исследуемых препаратов (табл. 3).

Таблица 3. Хроматограммы исследованных препаратов

Table 3. Chromatograms of the studied preparations

№ / No.	Препарат / Preparation	Хроматограмма / Chromatogram
1	Омега-3 Доппельгерц® Актив / Omega-3 Doppelherz® Active
2	Рыбий жир-Тева® / Fish oil-Teva®
3	Омегатрин® / Omegatrin®
4	Омега-3 концентрат® / Omega-3 concentrate®
5	Омегамама® / Omegamama®
6	Омеганол® / Omeganol®
7	Dear-Natura DHA®
8	Фемибион® Наталкер-2 / Femibion® Natalcare II
9	Элевит® Кормление / Elevit® Breastfeeding
10	Омакор® / Omacor®
11	Солгар® Oмега-3 700 / Solgar® Omega-3 700
12	Солгар® Oмега-3 950 / Solgar® Omega-3 950
13	NFO® Омега-3 Премиум / NFO® Omega-3 Premium
14	NFO® Omega-3 Strong DHA
15	NFO® Омега-3 Ультима / NFO® Omega-3 Ultima
16	Омега-3 Вкусвилл® / Omega-3 Vkusvill®

Примечание. Числа над пиками обозначают соединения, которые соответствуют данному пику.

Note. The numbers above the peaks denote the compounds that correspond to a given peak.

По качественному составу (наличие этиловых, пропиловых, бутиловых эфиров жирных кислот – см. табл. 2) образцы можно условно разделить на два типа:

– «естественные» жиры, которые, судя по жирнокислотному составу, аналогичны «рыбьему жиру» (например, хроматограмма образца № 2 Рыбий жир-Тева^®);

– «синтетические» жиры, содержащие в большом количестве не липиды, а эфиры жирных кислот.

На рисунке 1 приведена расшифровка хроматограммы одного из препаратов с высокой степенью очистки (образец № 15 – NFO^® Омега-3 Ультима).

Cодержание жирных кислот / Fatty acid content

По сравнению с нашим предыдущим исследованием [15], в настоящей работе расширен профиль жирнокислотного состава, который включил 10 дополнительных соединений. В таблице 4 представлены суммарные характеристики жирнокислотного состава (общее содержание ω3, ω6, ПНЖК, НЖК и других компонентов), вычисленные на основе 55-компонентных профилей. Других исследований, в которых был бы изучен такой расширенный профиль жирнокислотного состава достаточно обширной выборки препаратов на основе ω3-ПНЖК, ранее не проводилось.

При анализе наиболее очевидным наблюдением является существование препаратов с очень высоким суммарным содержанием ω3-ПНЖК (как правило, в форме ЭПК и ДГК). Например, общее содержание ω3-ПНЖК в среднем по всем исследованным препаратам составило 65,2±25,6% (ЭПК+ДГК: 57,9±27,2%). При упорядочении строк таблицы по общему проценту содержания ω3-ПНЖК отчетливо видны образцы препаратов с достаточно низким общим содержанием ω3-ПНЖК (Омеганол^® – 12,59%, Омегамама^® – 34,26% и др.) и препаратов с очень высоким содержанием ω3-ПНЖК: NFO^® Омега-3 Ультима – 98,85% (ЭПК+ДГК: 97,11%), Омакор^® – 97% (ЭПК+ДГК: 91,25%), NFO^® Omega-3 Strong DHA – 88,82% (ЭПК+ДГК: 86,65%), NFO^® Омега-3 Премиум – 87,03% (ЭПК+ДГК: 84,33%).

Как и в работе [15], изученные суммарные характеристики жирнокислотного состава в существенной степени коррелируют друг с другом. В частности, корреляционный анализ между заявленными и измеренными показателями жирнокислотного состава (табл. 5) показал высокодостоверные и выраженные прямые корреляции – положительные значения коэффициента корреляции (r) между заявленным и измеренным процентным содержанием ЭПК (r=0,91), ДГК (r=0,87), ЭПК+ДГК (r=0,87) и общим количеством ω3-ПНЖК (r=0,90). Таким образом, в целом по выборке заявленные производителями показатели содержания ω3-ПНЖК соответствуют полученным результатам.

В то же время выявлены сильные обратные корреляции между показателями содержания ω3-ПНЖК и содержания примесей жирных кислот (чему соответствуют отрицательные значения коэффициента корреляции). Например, обнаружены обратные корреляции между ЭПК+ДГК и ω6-ПНЖК (r=–0,57), ЭПК+ДГК и ω7+ω9+ω11-ПНЖК (r=–0,91), ω3-ПНЖК и ω7+ω9+ω11-ПНЖК (r=–0,92), ω3-ПНЖК и НЖК (r=–0,76). На рисунке 2 приведены отдельные примеры корреляций между заявленными и измеренными значениями различных суммарных показателей жирнокислотного состава.

Хорошо известно, что при оценке препаратов ω3-ПНЖК необходимо учесть относительное содержание ЭПК и ДГК [15][21]. Среди исследованных образцов наиболее высоким относительным содержанием ДГК отличались именно препараты ω3-ПНЖК, предназначенные для беременных (Элевит^® Кормление, Омегамама^®, Фемибион^® Наталкер-2 (рис. 3).

Метрические карты / Metric maps

Для оценки качества препаратов ω3-ПНЖК в целом и для нахождения сходств и отличий между исследованными образцами необходимо использовать все показатели профиля жирнокислотного состава. В таблице 6 приведены оценки расстояний между препаратами по метрике Колмогорова–Смирнова, которые мы представили и на метрической карте (рис. 4).

На метрической диаграмме на рисунке 4 каждому препарату (точка диаграммы) соответствует 55‑мерный вектор, отражающий комплекс измеренных соединений (см. табл. 1). Горизонтальная ось координат соответствует оценке примесного состава препаратов, вертикальная – содержанию ω3-ПНЖК. Очевидно существование двух четко отделяемых кластеров более стандартизированных и менее стандартизированных препаратов ω3-ПНЖК.

Оси диаграммы на рисунке 4 были получены посредством математического анализа данных методом многомерного шкалирования. Поэтому для количественной «расшифровки» горизонтальной и вертикальной осей координат необходимо, во-первых, провести анализ корреляций между содержанием в исследованных препаратах 55 соединений, перечисленных в таблице 1, а во-вторых, выявить наиболее информативные маркеры жирнокислотного состава препаратов.

В отличие от результатов работы [15], кластерный анализ корреляций между содержанием различных жирных кислот в 16 исследованных препаратах позволил выявить три кластера жирных кислот, отражающих важнейшие аспекты жирнокислотного состава препаратов на основе ω3-ПНЖК: ЭПК и ДГК (кластер 1), другие ω3-ПНЖК (кластер 2), насыщенные жирные кислоты (кластер 3, состоящий из двух подкластеров). На метрической диаграмме (рис. 5) каждой жирной кислоте или другому регистрируемому соединению соответствует одна точка, которой, в свою очередь, соответствует 16‑мерный вектор, отражающий содержание данного соединения в 16 исследованных препаратах. Таким образом, любые количественные оценки качества жирнокислотного состава препаратов должны в той или иной форме учитывать найденную кластерную структуру.

Для установления конкретных показателей биохимического качества стандартизации мы сравнили содержание всех 55 веществ в кластере более стандартизированных препаратов с содержанием этих веществ в кластере менее стандартизированных препаратов (табл. 7). На рисунке 6 приведены диаграммы состава исследованных препаратов в осях, соответствующих установленным маркерам.

Маркеры жирнокислотного состава / Fatty acid composition markers

В качестве наиболее информативных маркеров жирнокислотного состава были выбраны:

– маркеры «sum+» и «sum–»;

– общие содержания ω11 или ω7+ω9+ω11;

– ЭПК+ДГК и общее содержание ω3-ПНЖК.

Приведенные на рисунке 6 диаграммы состава исследованных препаратов в этих координатах наглядно иллюстрируют перечисленные варианты выбора маркеров. Так, при использовании пары маркеров «sum+» и «sum–» кластер стандартизированных препаратов не может быть отделен от кластера нестандартизированных препаратов одной разделяющей линией, а только двумя ломаными линиями. Это создает определенные неудобства при попытке сформулировать критерии (необходимо описать две линии плюс точку их пересечения – слишком много критериев). При использовании координат («ω11», «sum+») и («ω7+ω9+ω11», «ω3») кластеры разделяются одной линией, но расстояние между ними достаточно мало и разделяющая линия должна быть наклонной.

Однако в случае выбора пары координат («ω11», «ЭПК+ДГК») кластеры разделимы вертикальными линиями и находятся на существенном расстоянии друг от друга, что позволяет сформулировать однозначные критерии разделения кластеров: «ω11<3%», «ЭПК+ДГК>55%». Таким образом, наиболее приемлемыми для экспертного экспресс-анализа жирнокислотного состава препаратов являются маркеры «ω11» (ось Х на рисунке 4, примеси) и «ЭПК+ДГК» (ось Y на рисунке 4, полезное содержание). Это более практически важные критерии качества, чем предложенные ранее в работе [15].

Критерии качества / Quality criteria

Следует отметить, что в кластере более стандартизированных препаратов присутствуют не только лекарственный препарат Омакор^®, но и микронутриентные комплексы, зарегистрированные как «нутриентные биологически активные добавки» (NFO^® Омега-3 Премиум, NFO^® Omega-3 Strong DHA, NFO^® Омега-3 Ультима, Солгар^® Омега-3 950 и др.). Несмотря на указанное формальное различие в регистрации препарата, содержание ЭПК+ДГК, например, в препаратах линии NFO^® Омега-3 достаточно высоко (84–97%), а содержание НЖК (самых нежелательных примесей) не превышает 4,1%.

Более того, группа микронутриентных препаратов с высокой стандартизацией может эффективно использоваться в терапии пациентов с достаточно тяжелым врожденным неврологическим расстройством – синдромом Ретта (психоневрологическое наследственное заболевание, обусловленное мутациями в гене МЕСР2, кодирующем метил-СрG-связывающий белок). Например, в исследовании C. De Felice et al. [22] 20 пациентов на стадии I синдрома Ретта были рандомизированы (10 человек на группу) либо для перорального приема стандартизированных ω3-ПНЖК (NFO^® Omega-3 Strong DHA, ДГК 72,9±8,1 мг/кг/сут, ЭПК 117,1±13,1 мг/кг/сут, 6 мес) или плацебо. В результате терапии установлено снижение неврологических симптомов (в частности, двигательных расстройств, дефицитов невербальной коммуникации и нарушений дыхания) на фоне изменения уровней не связанного с белком железа, F2-дигомоизопростанов, F3-изопростанов, F4-нейропростанов и F2-изопростанов в плазме и/или эритроцитах [22].

Значение КСТ в процентах позволяет однозначно выделить препараты, в которых содержится больше полезной фракции ПНЖК, чем заявлено производителем. Наибольшими значениями КСТ отличались препараты линии NFO^® Омега-3 (Премиум: КСТ 147%; Strong DHA: КСТ 151%; Ультима: КСТ 139% (рис. 7).

Заметим, что препараты ω3-ПНЖК, из какой бы природной субстанции они ни приготовлялись, могут проходить существенную стандартизацию по составу. Например, в составе препарата NFO^® Омега-3 Ультима найдено самое высокое содержание ω3-ПНЖК (98,9%; ЭПК+ДГК: 97,1%) при нулевом содержании ω11. Конечно же, настолько стандартизированный по жирнокислотному составу экстракт, содержащий не более 18 индивидуальных веществ (всего 4 вещества, составляющие 99% жирнокислотного содержания), является, фактически, фармацевтическим стандартизированным препаратом с высокой степенью очистки, а никаким не «рыбьим жиром».

Полученные нами критерии качества препаратов ω3-ПНЖК позволяют количественно уточнить такие неадекватные термины, как «рыбий жир», и проводить своего рода «скрининговую» оценку качества стандартизации таких препаратов. В частности, выполнимость критериев «ω11<3%», «ЭПК+ДГК>55%» соответствует более стандартизированным препаратам лучшего качества очистки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Низкая обеспеченность ω3-ПНЖК связана, прежде всего, с нерациональным питанием (в т.ч. с так называемой западной диетой). Вследствие недостаточного потребления ω3-ПНЖК с пищей формируются ускоренное старение сосудов, атеросклероз, эндотелиальная дисфункция, тромбофилия. На фоне недостаточности в питании уже в зрелом и даже в молодом возрасте запускается патофизиологический механизм медленнотекущего хронического воспаления, сопровождающего большое число социально значимых заболеваний. В результате рано формируется коморбидная патология, приводящая к сокращению генетически заложенной оптимальной длительности жизни человека.

При дефиците потребления ω3-ПНЖК развиваются ишемическая болезнь сердца, хроническая ишемия головного мозга, нейродегенеративные, онкологические заболевания, лидирующие в списке основных причин смертности. Также на фоне низкой обеспеченности ω3-ПНЖК в достаточно молодом возрасте стартуют такие патологии, как остеоартрит и остеопороз, фотостарение кожи, дегенерация сетчатки глаза, синдром сухого глаза и т.д.

В работе предложены новые, более эффективные критерии оценки качества жирнокислотного состава препаратов ω3-ПНЖК: выполнимость критериев «ω11<3%», «ЭПК+ДГК>55%» соответствует более стандартизированным препаратам. Выявлены препараты с очень высокой степенью стандартизации по ω3-ПНЖК (NFO^® Омега-3 Ультима, NFO^® Omega-3 Strong DHA, Омакор^® и др.). Выделение высокостандартизированных составов позволяет врачам и пациентам делать информированный выбор при необходимости приема препаратов ω3-ПНЖК.