Изучение влияния эффективности гипонатриевого солезаменителя на показатели полиорганной патологии в экспериментальной модели «диетарного» старения на основе D-галактозы указывает на важную роль коррекции элементного баланса при солезависимой артериальной гипертонии и старении

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Гипосолевые и безнатриевые диеты трудно переносятся пациентами с артериальной гипертонией (АГ) и характеризуются низкой комплаентностью к лечению. Одним из перспективных направлений является использование гипонатриевых солезаменителей (ГНСЗ) при приготовлении пищи. Прообразом современных солезаменяющих смесей является морская соль, представляющая собой естественную комбинацию хлоридов натрия, магния и калия, сульфатов магния и кальция, бромида и карбоната магния, которая была предложена в качестве альтернативы столовой соли [1]. Исследовательская программа INTERSALT убедительно показала важность этого подхода для профилактики и лечения АГ [2].

При разработке заменителей поваренной соли следует решить вопрос о включении в их состав хлорида натрия. Например, начиная с 1970-х гг. выпускается отечественная диетическая соль Санасол^®, которая является безнатриевой солевой смесью. Ее применение при ограничении поваренной соли в диете у пациентов с АГ снижает солевой голод, способствует нормализации артериального давления, позволяет снизить дозы диуретиков и бета-адреноблокаторов [3][4]. При исследовании солезаменителей известны случаи повышения секреции альдостерона, гиперкалиемии, особенно на фоне приема калийсберегающих диуретиков [5].

По мере углубления представлений о роли различных ионов в регуляции артериального давления стали появляться более сложные комбинации солей. ГНСЗ был разработан на кафедре фармакологии ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный медицинский университет» Минздрава России. Данный препарат представляет собой оригинальный заменитель поваренной соли с пониженным содержанием натрия хлорида и включением органических и неорганических солей калия, магния, кальция, глютаминовой кислоты. Он хорошо имитирует вкус поваренной соли (3,6 балла, 4,3 балла для хлорида натрия), имеет низкую токсичность (ЛД50¹ 12,8±1,5 г/кг массы при введении крысам в желудок; ЛД50 для хлорида натрия – 7,0±1,3 г/кг), снижает солевой голод, имеет выраженный антигипертензивный, противоотечный эффекты, на модели АГ и сердечной недостаточности оказывает благоприятные метаболические эффекты².

Таким образом, несмотря на накопленные данные о способности ГНСЗ снижать артериальное давление и улучшать отдельные кардиометаболические показатели, системные эффекты подобных вмешательств в условиях комплексных диетарных факторов риска остаются изученными недостаточно. В частности, ограниченно число экспериментальных работ, оценивающих влияние солезаменителей на формирование полиорганной патологии, включая нарушения функции почек, печени, обмена железа, системного воспаления и поведенческих проявлений, характерных для ускоренного старения. Между тем именно сочетание высокой натриевой нагрузки, избыточного потребления насыщенных жиров, метаболических нарушений и прооксидантных факторов рассматривается как важный патогенетический механизм возраст-ассоциированной патологии. В связи с этим представляет интерес экспериментальная оценка эффектов ГНСЗ в моделях, воспроизводящих комплекс диетарных факторов риска и связанных с ними системных нарушений.

Цель – изучение эффектов приема ГНСЗ на модели ускоренного «диетарного» старения у белых крыс, вызванного D‑галактозой в сочетании с пальмовым маслом, L-метионином в диете, хлоридом натрия в питьевой воде и сульфатом железа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Экспериментальные животные / Experimental animals

Исследование было выполнено на 30 крысах-самцах линии Wistar массой 300–500 г., которые были распределены на четыре группы так, чтобы индивидуальное значение массы тела не отклонялось от среднего по группе более чем на 20%. Взвешивание осуществляли на электронных весах для взвешивания крыс/мышей (Cas Corporation, Россия).

В первой группе (n=6, интактный контроль, возраст 3,5 мес) животные получали нормальную диету и питье в виде чистой питьевой воды. Во второй группе (n=6, естественное старение, возраст более 1 года) крысы также получали нормальную диету и питье в виде чистой питьевой воды. В третьей (n=12) и четвертой (n=6) группах возраст животных составлял 3,5 мес и воспроизводилась модель старения.

Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с СП 2.2.1.3218-14³ (в поликарбонатных клетках, группами одного пола (самцы), на подстилке, клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением). В качестве подстилки использовались опилки. Корм для содержания лабораторных животных ЛБК-120 (АО «БиоПро», Россия), приготовленный по ГОСТ Р50258-92⁴, давался ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Данные о составе и качестве корма от производителя хранились в документации лаборатории и в файле исследования. Животным давалась вода ad libitum в стандартных поилках со стальными крышками-носиками, соответствующая ГОСТ Р51232-98⁵.

Соблюдались контролируемые условия окружающей среды (18–26 °C, относительная влажность воздуха 30–70%). В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения. Контроль условий окружающей среды осуществлялся измерителем комбинированным Testo (TestoAG, Германия) и фиксировался в соответствующем журнале. Для акклиматизации лабораторные животные до начала исследования содержались 5 дней в одиночных клетках. Во время этого периода у них ежедневно контролировалось клиническое состояние путем визуального осмотра. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями не были включены в экспериментальные группы.

Модель ускоренного старения / Accelerated aging model

Модель старения воспроизводили следующим образом: животным в течение 12 сут в питание включали пальмовое масло в дозе 30 г/кг/сут (CandleM, Индонезия), раствор D‑галактозы в дозе 0,5 г/кг/сут (САS 59-23-4, Himedia, Индия) и L-метионин в дозе 0,15 г/кг/сут per os путем зондирования (САS 63-68-3, ServiceBio), 1% раствор натрия хлорида в виде питья, а также внутрибрюшинно вводили железо сернокислое – 25 мг/кг/сут (АО «ЛенРеактив», Россия).

Разработанная модель ускоренного старения ориентирована на реалистичное моделирование нарушений диеты, которые повсеместны для различных популяций человека, в т.ч. в пожилом возрасте. Так, перегрузка D‑галактозой нарушает углеводный обмен и ускоряет нейродегенеративные изменения мозга, характерные для пожилых людей. Перегрузка хлоридом натрия соответствует формированию солезависимых форм АГ. Перегрузка насыщенными жирами пальмового масла создает условия для атерогенеза сосудов и дисфункции печени. Нарушения печени усиливаются вследствие перегрузки метионином, трансформирующимся в избыток гомоцистеина (особенно на фоне дефицита потребления фолатов), вызывая эндотелиальную дисфункцию. Перегрузка железом усиливает эндотелиопатию, атерогенез, нарушения функции печени, также стимулируя развитие полиорганной патологии, характерной для пожилых.

Ход эксперимента / Experimental process

Через 13 дней от начала эксперимента крысам контрольной группы, группы естественного старения и группы «модель старения» (n=6) вводили золазепам (Золетил^®, Virbac, Франция) в дозировке 20 мг (10 мг золазепама + 10 мг тилетамина), забирали кровь для биохимического анализа и секционный материал (печени, почек, мозга, сердца, кожи) для патоморфологического анализа. У крыс с моделью старения проводили неврологическое тестирование: тест «открытое поле» и плавательный тест.

Остальных крыс переводили на нормальную диету и обычный питьевой режим. С 13‑го дня исследования в третьей группе «модель старения» (n=6) животные медикаментозного лечения не получали. Одновременно в четвертой группе «модель старения + ГНСЗ» животные получали препарат (1% раствор, 0,02 мг/мл/сут) per os в течение 1 мес. На 54‑й день исследования животных из третьей (n=6) и четвертой (n=6) групп наркотизировали, проводили забор крови для биохимического анализа и секционного материала (печени, почек, мозга, сердца, кожи) для патогистологического изучения.

Оцениваемые показатели / Evaluated indicators

Наблюдения за животными проводили ежедневно. Фиксировали общее состояние, аппетит, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, частоту и глубину дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс. На 0‑й, 13‑й, 54‑й дни в крови определяли показатели, перечисленные в таблице 1.

Патогистологическое исследование секционного материала / Histopathological examination of autopsy specimens

На 13‑й и 54‑й дни исследования животных выводили из эксперимента путем достижения наркозной смерти с использованием золазепама (Золетил^®, Virbac, Франция). Посредством краниотомии головной мозг извлекали целиком и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут с помощью фронтальных разрезов выделяли зону прецентральной извилины переднего мозга, мозжечок, ствол головного мозга.

После эвисцерации сердце, печень, почки и фрагменты кожного покрова фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут ткани препарировали, выделяли фрагменты миокарда левого желудочка, правой и левой долей печени, кортикальные отделы правой и левой почек, которые повторно фиксировали. После вторичной фиксации и промывки материала проводку (обезвоживание) тканей головного мозга, печени и почек осуществляли с помощью 99% изопропилового спирта. В дальнейшем кусочки заливали парафином и изготовленные на санном микротоме Microm^® HM 325 (Thermo Fisher Scientific Microm International GmbH, Германия) гистологические срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Дубликаты срезов с помощью набора реактивов компании ООО «БиоВитрум» (Россия) окрашивали по Перльсу для выявления в тканях трехвалентного железа. Результатом проведенной реакции должно быть образование окрашенной в синий цвет соли – берлинской лазури.

Статистический анализ / Statistical analysis

Для изученных показателей проводили подсчет среднего и стандартного отклонения (M±m). Оценку статистической достоверности осуществляли по критерию Манна–Уитни. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. При необходимости тесты на нормальность распределения выполняли с помощью визуального анализа наблюдаемых и ожидаемых гистограмм распределения данных с подтверждением тестом χ² нулевой гипотезы об отсутствии отличий между наблюдаемым распределением и ожидаемым нормальным распределением (р>0,05). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США) и таблиц MS Excel (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Результаты экспериментального исследования показали, что при воспроизведении модели формируется комплекс нарушений, включающий отклонения биомаркеров полиорганной патологии, нарушения кроветворения и ухудшение неврологического состояния животных. Применение ГНСЗ с 13‑го по 54‑й день эксперимента обращало вспять эти неблагоприятные изменения. Для некоторых показателей ГНСЗ способствовал восстановлению значений до интервалов нормы, характерных для группы интактных животных.

Биомаркеры полиорганной патологии / Multiple organ pathology biomarkers

В случае изученных биомаркеров полиорганной патологии (табл. 2) воспроизведение модели приводило к поражению почек (изменения креатинина, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), уровней натрия) и печени (изменения показателей аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы (АЛТ), фолатов, витамина В12, ферритина). Применение ГНСЗ в ряде случаев компенсировало нарушения, возникающие при воспроизведении модели.

Функции почек

Прежде всего следует отметить изменения показателей функции почек. При воспроизведении модели наблюдалось повышение креатинина в сыворотке (интактные: 35,67±1,21 мкмоль/л; модель, 54‑й день: 39,17±1,47 мкмоль/л; р=0,000628) на фоне достоверного снижения СКФ (интактные: 167,41±7,26 мл/мин/1,73 м²; модель, 54‑й день: 153,4±6,32 мл/мин/1,73 м²; р=0,002646). Эти изменения указывают на повреждение тканей почек и обусловленное этим снижение функциональной активности почек при воспроизведении модели ускоренного «диетарного» старения. ГНСЗ способствовал восстановлению уровней креатинина в сыворотке (модель, 54‑й день: 39,17±1,47 мкмоль/л; ГНСЗ: 33,33±1,86 мкмоль/л; р=0,000628) и СКФ (модель, 54‑й день: 153,4±6,32 мл/мин/1,73 м²; ГНСЗ: 181,1±12,27 мл/мин/1,73 м²; р=0,002646) в сторону значений, нормальных для интактных животных.

Функции печени

Полиорганные поражения, возникающие при воспроизведении модели, также затрагивали состояние и биосинтетическую функцию печени. При воспроизведении модели установлено возрастание уровней АЛТ (интактные: 22,78±3,20 Ед/л; модель, 54‑й день: 39,10±1,18 Ед/л; р=0,000008) и витамина В12 (интактные: 264,50±58,12 пг/мл; модель, 54‑й день: 380,50±29,04 пг/мл; р=0,001451), что указывает на усиленное повреждение гепатоцитов. В то же время биосинтез фолатов в печени снижался (интактные: 50,82±14,01 нмоль/л; модель, 54‑й день: 26,82±5,99 нмоль/л; р=0,003321).

Применение ГНСЗ приводило к изменению АЛТ в сторону значений интактных животных (модель, 54‑й день: 39,10±1,18 Ед,/л; ГНСЗ: 28,30±2,87 Ед/л; р=0,000008; интактные: 22,78±3,20 Ед/л), восстановлению уровней витамина В12 (модель, 54‑й день: 380,50±29,04 пг/мл; ГНСЗ: 275,00±49,29 пг/мл; р=0,001451, что достоверно не отличалось от значений для интактных животных) и к небольшому повышению уровней фолатов в сторону значений, нормальных для группы интактных животных (модель, 54‑й день: 26,82±5,99 нмоль/л; ГНСЗ: 29,77±5,36 нмоль/л; р=0,003321; интактные: 50,82±14,01 нмоль/л).

Обмен железа

Воспроизведение модели приводило к нарушениям обмена железа и уровней электролитов в крови: установлено возрастание коэффициента насыщения трансферрина железом (интактные: 29,48±8,29%; модель, 54‑й день: 69,88±11,79%; р=0,053335) и натрия в сыворотке (интактные: 140,03±1,65 ммоль/л; модель, 54‑й день: 141,42±1,30 ммоль/л; р=0,069579) при падении уровней магния (интактные: 1,25±0,08 ммоль/л; модель, 54‑й день: 1,12±0,01 ммоль/л; р=0,004019) и калия (интактные: 7,95±0,33 ммоль/л; модель, 54‑й день: 7,29±0,05 ммоль/л; р=0,002001) в сыворотке.

ГНСЗ способствовал восстановлению обмена железа и электролитов, нормализуя значения коэффициента насыщения трансферрина железом (модель, 54‑й день: 69,88±11,79%; ГНСЗ: 46,70±10,80%; р=0,053335, что достоверно не отличалось от значений для интактных животных), магния (модель, 54‑й день: 1,12±0,01 ммоль/л; ГНСЗ: 1,22±0,14 ммоль/л; р=0,004019, что достоверно не отличалось от значений для интактных животных), натрия (модель, 54‑й день: 141,42±1,30 ммоль/л; ГНСЗ: 138,13±1,61 ммоль/л; р=0,069579) и калия (модель, 54‑й день: 7,29±0,05 ммоль/л; ГНСЗ: 8,06±1,72 ммоль/л; р=0,002001, что достоверно не отличалось от значений для интактных животных) в сыворотке.

Кроветворение / Hematopoiesis

Анализ значений показателей общего анализа крови (табл. 3) позволяет утверждать, что воспроизведение модели негативно сказывается на процессах кроветворения (нарушения распределения размеров эритроцитов и тромбоцитов, уровней других форменных элементов крови) и сопровождается, в частности, возрастанием хронического системного воспаления (скорость оседания эритроцитов (СОЭ), уровни лейкоцитов, в т.ч. нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и др.). Применение ГНСЗ приводило к нормализации значений большинства показателей к интервалам нормы.

Воспроизведение модели приводило к выраженному усилению провоспалительного фона: установлены достоверные повышения уровней лейкоцитов (интактные: 4,63±1,26×10⁹/л; модель, 54‑й день: 9,21±0,40×10⁹/л; р=0,000074), нейтрофилов (интактные: 1,70±0,95×10⁹/л; модель, 54‑й день: 2,66±0,70×10⁹/л; р=0,038399), моноцитов (интактные: 0,52±0,23×10⁹/л; модель, 54‑й день: 0,70±0,09×10⁹/л; р=0,064528), эозинофилов (интактные: 0,11±0,07×10⁹/л; модель, 54‑й день: 0,17±0,01×10⁹/л; р=0,050041), нейтрофилов (интактные: 40,95±15,28%; модель, 54‑й день: 28,75±7,01%; р=0,059321). Возрастание хронического воспаления подтверждалось и повышением уровней СОЭ (интактные: 15,00±10,32 мм/ч; модель, 54‑й день: 36,50±1,38 мм/ч; р=0,001765).

Использование ГНСЗ способствовало ослаблению хронического воспаления. Оно приводило к нормализации уровней лейкоцитов (модель, 54‑й день: 9,21±0,40×10⁹/л; ГНСЗ: 6,67±2,50×10⁹/л; р=0,000074), нейтрофилов (модель, 54‑й день: 2,66±0,70×10⁹/л; ГНСЗ: 2,80±0,80×10⁹/л; р=0,038399), В случае других показателей значения полностью возвращались к норме и достоверно не отличались от значений для интактных животных, что наглядно видно по уровням моноцитов (модель, 54‑й день: 0,70±0,09×10⁹/л; ГНСЗ: 0,56±0,31×10⁹/л; р=0,064528), эозинофилов (модель, 54‑й день: 0,17±0,01×10⁹/л; ГНСЗ: 0,08±0,01×10⁹/л; р=0,050041), нейтрофилов (модель, 54‑й день: 28,75±7,01%; ГНСЗ: 43,67±5,68%; р=0,059321) и СОЭ (модель, 54‑й день: 36,50±1,38 мм/ч; ГНСЗ: 17,00±12,03 мм/ч; р=0,001765).

ГНСЗ практически не оказывал влияния на некоторые эритоцитарные показатели кроветворения, которые нарушались при воспроизведении модели ускоренного старения, включая уровни эритроцитов (интактные: 6,15±0,55×10¹²/л; модель, 54‑й день: 8,21±0,37×10¹²; р=0,00002), гемоглобина (интактные: 148,83±4,54 г/л; модель, 54‑й день: 143,50±1,87 г/л; р=0,016941), гематокрит (интактные: 48,97±2,27%; модель, 54‑й день: 43,67±0,96%; р=0,000659) и среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (интактные: 285,67±31,24 г/л; модель, 54‑й день: 327,50±1,05 г/л; р=0,010961).

Применение ГНСЗ также не приводило к улучшению показателей тромбоцитарного кроветворения, которые нарушались при воспроизведении модели, включая уровни тромбоцитов (интактные: 509,67±121,63×10⁹/л; модель, 54‑й день: 844,50±19,36×10⁹/л; р=0,000475; ГНСЗ: 1083,33±360,06×10⁹/л), средний объем тромбоцита (интактные: 7,75±0,47 фл; модель, 54‑й день: 7,35±0,29 фл; р=0,056624; ГНСЗ: 7,27±0,14 фл) и коэффициент больших тромбоцитов (интактные: 12,87±2,27%; модель, 54‑й день: 10,25±1,89%; р=0,028062; ГНСЗ: 9,60±0,24%).

В то же время ГНСЗ способствовал нормализации среднего объема эритроцита (интактные: 49,08±2,50 фл; модель, 54‑й день: 52,45±1,15 фл; р=0,009999; ГНСЗ: 50,43±4,33 фл; р=0,010000), коэффициента вариации распределения эритроцитов (интактные: 14,72±0,55%; модель, 54‑й день: 15,45±0,10%; р=0,010712; ГНСЗ: 15,07±0,88%; р=0,010712) и, в особенности, показателей ретикулоцитов и фракций флюоресценции.

Воспроизведение модели ускоренного старения приводило к падению фракции незрелых ретикулоцитов (интактные: 43,25±6,07%; модель, 54‑й день: 26,70±0,90%; р=0,000506), фракций средней (интактные: 19,35±3,21%; модель, 54‑й день: 14,15±3,13%; р=0,008723) и высокой (интактные: 20,85±1,99%; модель, 54‑й день: 12,60±4,24%; р=0,001688) флюоресценции, тогда как фракция низкой флюоресценции возрастала (интактные: 63,80±8,60%; модель, 54‑й день: 73,25±1,60%; р=0,021332).

Применение ГНСЗ фактически обращало вспять все эти неблагоприятные изменения, т.к. приводило к значениям данных показателей, достоверно не отличавшимся от значений для интактных животных в случае фракции незрелых ретикулоцитов (модель, 54‑й день: 26,70±0,90%; ГНСЗ: 42,90±4,16%; р=0,000506), фракции низкой флюоресценции (модель, 54‑й день: 73,25±1,60%; ГНСЗ: 57,10±4,16%; р=0,021332), фракции средней флюоресценции (модель, 54‑й день: 14,15±3,13%; ГНСЗ: 19,07±2,71%; р=0,008723) и фракции высокой флюоресценции (модель, 54‑й день: 12,60±4,24%; ГНСЗ: 23,83±6,08%; р=0,001688).

Неврологическое тестирование / Neurological testing

Результаты неврологического тестирования животных, проведенного с использованием методики «открытое поле» и теста Порсолта (табл. 4), показали, что возникающие при воспроизведении модели неврологические нарушения успешно компенсировались c использованием ГНСЗ.

В тесте «открытое поле» при воспроизведении модели старения установлено достоверное подавление всех разновидностей горизонтальной и вертикальной активностей животных: горизонтальная – темные области (интактные: 66,00±9,21 у.е.; модель, 54‑й день: 38,00±5,66 у.е.; р=0,00009), светлые области (интактные: 38,00±5,83 у.е.; модель, 54‑й день: 9,50±2,17 у.е.; р=0,00001), общее значение (интактные: 104,00±15,03 у.е.; модель, 54‑й день: 47,17±7,60 у.е.; р=0,00003); вертикальная – стенка (интактные: 14,00±2,28 у.е.; модель, 54‑й день: 5,83±0,75 у.е.; р=0,00008), на вису (интактные: 3,00±0,89 у.е.; модель, 54‑й день: 1,00±0,63 у.е.; р=0,00077), общее значение (интактные: 17,00±3,03 у.е.; модель, 54‑й день: 6,83±1,33 у.е., р=0,00008). Снизились число обследованных норок (интактные: 5,00±0,89 у.е.; модель, 54‑й день: 3,17±0,75 у.е.; р=0,00172) и количество периодов короткого груминга (интактные: 5,00±0,89 у.е.; модель, 54‑й день: 1,17±0,75 у.е.; р=0,00001) на фоне увеличения количества болюсов (интактные: 4,00±0,89 у.е.; модель, 54‑й день: 7,00±0,89 у.е.; р=0,00009). Описанные изменения показателей теста указывают на формирование у животных дистресса, переходящего в своего рода «апатию» («депрессию»).

Применение ГНСЗ приводило к частичной, но достоверной компенсации клинико-неврологических нарушений, вызванных воспроизведением модели ускоренного диетарного старения. В тесте «открытое поле» восстановление показателей в сторону значений в группе интактных животных отмечено для горизонтальной активности в темных (модель, 54‑й день: 38,00±5,66 у.е.; ГНСЗ: 44,17±5,56 у.е.; р=0,000095) и светлых (модель, 54‑й день: 9,50±2,17 у.е.; ГНСЗ: 15,00±3,29 у.е.; р=0,00001) областях, для вертикальной активности на стенке (модель, 54‑й день: 5,83±0,75 у.е.; ГНСЗ: 6,33±1,37 у.е.; р=0,000076) и на вису (модель, 54‑й день: 1,00±0,63 у.е.; ГНСЗ: 1,83±0,75 у.е.; р=0,000775), увеличивалось число периодов короткого груминга (модель, 54‑й день: 1,17±0,75 у.е.; ГНСЗ: 3,00±0,89 у.е.; р=0,000007). Значения после терапии достоверно не отличались от значений для интактных животных для длительного груминга (модель, 54‑й день: 1,17±0,75 у.е.; ГНСЗ: 1,83±0,75 у.е.; р=0,032718) и для числа болюсов (модель, 54‑й день: 7,00±0,89 у.е.; ГНСЗ: 4,67±0,82 у.е.; р=0,000085).

В тесте Порсолта получены схожие рехультаты: при воспроизведении модели увеличивалось время неподвижности (интактные: 135,00±7,07 с; модель, 54‑й день: 182,00±3,58 с; р=0,000001), сокращалось время активного плавания (интактные: 106,00±3,74 с; модель, 54‑й день: 68,83±2,64 с; р=0,0002) и время борьбы (интактные: 59,00±5,29 с; модель, 54‑й день: 49,17±1,33 с; р=0,002619). Применение ГНСЗ приводило к восстановлению значений этих показателей: время неподвижности (модель, 54‑й день: 182±3,58 с; ГНСЗ: 135,83±3,06 с; р=0,000001), время активного плавания (модель, 54‑й день: 68,83±2,64 с; ГНСЗ: 99,33±1,63 с; р=0,002723), время борьбы (модель, 54‑й день: 49,17±1,33 с; ГНСЗ: 60,50±3,02 с; р=0,002619) после терапии достоверно не отличались от значений в группе интактных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

Ключевой результат / Key result

Главный результат исследования состоит в том, что применение ГНСЗ после индукции модели (с 13‑го по 54‑й день) сопровождалось уменьшением выраженности полиорганной патологии и функциональных нарушений, включая:

– нормализацию почечных показателей (снижение креатинина и восстановление расчетной СКФ);

– ослабление маркеров гепатоцеллюлярного повреждения (снижение АЛТ) и частичную нормализацию показателей, косвенно отражающих печеночную дисфункцию и одноуглеродный обмен (сывороточные фолаты / витамин B12);

– сдвиг показателей системного воспаления и кроветворения в сторону интактных значений (снижение лейкоцитоза и СОЭ, восстановление ретикулоцитарных фракций);

– поведенческую компенсацию нарушений в тестах «открытое поле» и Порсолта.

Эти результаты в целом согласуются с исходной логикой применения ГНСЗ: снижение натриевой нагрузки при одновременном увеличении поступления катионов (прежде всего, калия и магния) теоретически должно уменьшать солезависимые сосудисто-почечные и воспалительные эффекты и тем самым ослаблять вклад «диетарных» факторов риска в фенотип ускоренного старения. Подобное направление воздействия согласуется с клиническими и популяционными данными о том, что стратегии замещения соли (меньше натрия, больше калия) снижают артериальное давление и улучшают прогноз по сердечно-сосудистым исходам в группах риска. Эти подходы поддерживаются и рекомендациями Всемирной организации здравоохранения по ограничению натрия и использованию низконатриевых солезаменителей в общей взрослой популяции при исключении лиц с нарушением экскреции калия [6][7].

Улучшение функции почек наблюдалось параллельно с нормализацией электролитного профиля, снижение воспалительных показателей сопровождалось восстановлением ретикулоцитарных фракций, поведенческая компенсация сочеталась с системными улучшениями обмена и воспаления. Эти сопряженные изменения правдоподобно отражают системный (а не органоспецифический) эффект вмешательства в условиях мультифакторной модели старения.

Почечная дисфункция и электролитный баланс / Renal dysfunction and electrolyte balance

В исследовании индукция модели сопровождалась признаками ухудшения функции почек: повышение уровня креатинина и снижение расчетной СКФ к 54-му дню. На фоне применения ГНСЗ наблюдалось значимое улучшение: креатинин снижался до значений, сопоставимых с интактными животными, а расчетная СКФ возрастала, превышая уровень группы «модель» и приближаясь к интактному диапазону. Одновременно отмечались нормализация магния и сдвиг натрия в сыворотке в сторону более низких значений относительно «модели», калий также демонстрировал тенденцию к восстановлению.

Сопоставление с литературой показывает, что такие изменения биологически правдоподобны. Высокая солевая нагрузка рассматривается как фактор, ухудшающий функцию почек не только через повышение давления, но и через эффекты на внутрипочечную гемодинамику, окислительный стресс и повреждение канальцевого эпителия. Механистические работы демонстрируют усиление реактивных форм кислорода и воспалительных каскадов при высокосолевом воздействии, а клинические/трансляционные обзоры подчеркивают связь высокой натриевой нагрузки с нарушением почечных показателей и метаболического баланса [8]. Рандомизированные данные у людей подтверждают, что увеличение калия снижает давление без неблагоприятного влияния на почечную функцию у взрослых при отсутствии противопоказаний, а современные обзоры подчеркивают центральную роль почек в калий-опосредованном снижении давления и натрийурезе [9].

Печеночные изменения и ось «железо – окислительный стресс» / Liver changes and iron – oxidative stress axis

В модели к 54-му дню отмечалось усиление биохимических признаков гепатоцеллюлярного повреждения (рост АЛТ), а также изменения маркеров, которые часто интерпретируются в контексте печеночной дисфункции и одноуглеродного обмена: снижение уровня фолатов и повышение сывороточного витамина B12. На фоне применения ГНСЗ концентрация АЛТ снижалась, витамин B12 возвращался к значениям, близким к интактным, а фолаты демонстрировали частичную компенсацию (без полного восстановления до интактного уровня).

Для модели D‑галактозы накоплены свидетельства, что она воспроизводит важные механистические компоненты старения (оксидативный стресс, гликацию, митохондриальную дисфункцию) и может приводить к полиорганным изменениям [10].

В нашем дизайне к этому добавлены факторы, которые сами по себе способны усиливать печеночную уязвимость: высокожировой компонент (как модельный аналог «западного» питания) и прооксидантная нагрузка железом. Причем железо рассматривается как ключевой усилитель липопероксидации и клеточного повреждения: при перегрузке железом описан вклад железозависимой липидной пероксидации и ферроптоза в повреждение печени, а обзоры по ферроптозу подчеркивают роль избытка железа в превышении антиоксидантной способности клетки и запуске каскада повреждения [11].

Отдельного комментария требует повышение уровня витамина B12. В клинической литературе подчеркивается, что высокие концентрации B12 в сыворотке при отсутствии экзогенного введения могут возникать при заболеваниях печени из-за высвобождения связанного B12 при цитолизе гепатоцитов и/или снижения печеночного клиренса транспортных форм кобаламина [12]. Следовательно, динамика B12 в нашей модели логично поддерживает трактовку «печеночного компонента» полиорганной патологии и представляет собой дополнительный аргумент в пользу гепатопротекторного эффекта ГНСЗ.

Воспаление и показатели крови / Inflammation and blood counts

Показатели общего анализа крови и СОЭ в исследовании указывают на системный воспалительный сдвиг при воспроизведении модели: выраженный лейкоцитоз и рост СОЭ к 54-му дню, а также изменения лейкоформулы и тромбоцитарного звена. На фоне применения ГНСЗ лейкоцитоз уменьшался, а СОЭ снижалась практически до интактных значений. Одновременно наиболее информативным блоком выглядят ретикулоцитарные фракции: в группе «модель» снижалась фракция незрелых ретикулоцитов и доли средне- и высокофлюоресцентных ретикулоцитов при увеличении низкофлюоресцентной фракции, а при использовании ГНСЗ эти параметры возвращались к уровням, близким к интактным.

Хроническое стерильное низкоинтенсивное воспаление рассматривается как один из ключевых «механистических столпов» старения и фон, на котором ускоряется прогрессирование возраст-ассоциированных заболеваний. Влиять на него могут как нутритивные факторы, так и метаболические сигналы. В этом контексте снижение лейкоцитоза и СОЭ на фоне применения ГНСЗ можно интерпретировать как ослабление системного воспалительного компонента модели.

Ретикулоцитарные фракции целесообразно трактовать как маркеры динамики эритропоэза и стресс-ответа костного мозга. Современная гематологическая литература указывает, что ретикулоцитарные фракции отражают раннюю эритропоэтическую активность, а разделение ретикулоцитов по флюоресценции соответствует степени зрелости [13]. Следовательно, сдвиг к более зрелым фракциям в группе «модель» может отражать угнетение/замедление ранних стадий эритропоэза или дисрегуляцию созревания на фоне воспаления и метаболического стресса, а восстановление степени содержания нуклеиновых кислот при применении ГНСЗ – косвенно указывать на нормализацию регуляции кроветворения.

Неврологическое состояние и поведенческие тесты / Neurological status and behavioral tests

В тесте «открытое поле» у животных с моделью наблюдались снижение горизонтальной и вертикальной активности, уменьшение груминга и одновременное увеличение числа болюсов. Такая комбинация обычно обсуждается как снижение исследовательского поведения / локомоторной активности с признаками повышенной эмоциональной реактивности. На фоне использования ГНСЗ отмечались частичная/существенная компенсация показателей активности и нормализация количества болюсов.

Эта динамика согласуется с общими представлениями о поведенческих эффектах D‑галактозной модели: систематические обзоры и экспериментальные работы демонстрируют, что насыщение диеты D‑галактозой может сопровождаться нейроповеденческими нарушениями на фоне оксидативного стресса и воспаления. При этом важно признать, что существуют публикации, где определенные режимы D‑галактозы не приводили к ожидаемым изменениям исследовательского поведения или тревожности, что подчеркивает зависимость эффекта от дозы/длительности/пути введения и сопутствующих факторов [10].

В тесте Порсолта в модели увеличивалось время неподвижности и снижалось время активного плавания/борьбы. На фоне применения ГНСЗ время неподвижности практически возвращалось к интактному уровню, а активные компоненты поведения частично/полностью восстанавливались. Классическая интерпретация теста связывает рост неподвижности с «депрессивно-подобным» поведением или пассивной стратегией копинга, однако в современных руководствах подчеркиваются ограничения и неоднозначность трактовок (влияние моторных эффектов, обучения, протокола, условий содержания) [14].

Новизна и значимость полученных данных / Novelty and significance of obtained data

С точки зрения научной новизны статья добавляет важный аргумент в пользу того, что солезаменители могут рассматриваться не только как инструмент снижения потребления натрия, но и как потенциальное вмешательство, способное модифицировать системный фенотип диетарно-обусловленного ускоренного старения на уровне функциональных маркеров органов-мишеней, воспаления и поведения. Это расширяет рамку интерпретации эффектов ГНСЗ: от сугубо гемодинамического (через давление) к многокомпонентному (через электролитный баланс, почечно-сосудистую ось, воспалительный фон и, вероятно, прооксидантные каскады).

Практическая значимость заключается в том, что исследование связывает управляемое нутритивное вмешательство с измеримыми устойчивыми биомаркерами органов-мишеней (по крайней мере на уровне креатинина/СКФ и АЛТ), а также демонстрирует, что на фоне применения ГНСЗ улучшаются параметры, отражающие системное воспаление и кроветворение. Учитывая растущее значение глобальных рекомендаций по снижению потребления натрия и внедрению ГНСЗ, такие экспериментальные данные могут рассматриваться как доклиническое обоснование для более целевых клинических исследований в группах с солезависимыми и метаболическими рисками.

Ограничения исследования и их возможное влияние на выводы / Limitations of the study and their possible impact on conclusions

Во-первых, размеры групп в ключевых сравнениях ограниченны, а число анализируемых показателей велико. При множественных сравнениях без коррекции возрастает риск ложноположительных находок. Кроме того, некоторые эффекты выглядят пограничными по p-значениям (например, показатели железа), что требует осторожной формулировки выводов («тенденция», «частичная нормализация») и подтверждения в расширенной выборке или независимом эксперименте.

Во-вторых, модель и вмешательство мультикомпонентны: одновременно задействованы D‑галактоза, жировой компонент, метионин (через гипергомоцистеинемию), солевая и железовая нагрузки. Это усиливает реалистичность модельного аналога сложной диеты, но ограничивает возможность связать наблюдаемые изменения с одним конкретным путем, а также усложняет объяснение контрастов с более узкопрофильными D‑галактозными протоколами, где эффекты бывают менее выражены.

В-третьих, часть ключевых механизмов в работе не измерялась напрямую: не представлены маркеры оксидативного стресса, цитокины / острофазные белки, параметры ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, а для натриевой нагрузки не использована оценка экскреции натрия/калия (24-часовая моча), которая считается наиболее валидной для количественной оценки соли. При этом сывороточный натрий физиологически слабо отражает натриевое потребление из-за жесткой гомеостатической регуляции.

В-четвертых, поведенческие тесты чувствительны к условиям содержания и вмешательствам экспериментатора, а тестирование Порсолта имеет известные ограничения интерпретации. Эти факторы могут вносить систематическую вариабельность, которая должна быть признана как возможный источник неопределенности.

В-пятых, исследование выполнено на самцах в пределах одной линии, что ограничивает экстраполяцию на самок и на иные генетические фоны. С учетом половых различий в воспалительных и метаболических путях это следует обозначить как ограничение внешней валидности.

Итоговый вывод и перспективы / Final summary and prospects

В совокупности полученные данные поддерживают вывод о том, что ГНСЗ в условиях комплексной «диетарной» модели ускоренного старения уменьшает выраженность функциональных проявлений полиорганной патологии (прежде всего, почечной и печеночной), ослабляет воспалительный компонент (на уровне лейкоцитоза и СОЭ), нормализует параметры, отражающие регуляцию кроветворения (ретикулоцитарные фракции), и сопровождается улучшением поведенческих показателей.

Перспективные вопросы для дальнейших исследований логично сформулировать так:

– какие механистические звенья являются ведущими (натрийурез / ренин-ангиотензин-альдостероновая система, антиоксидантные эффекты катионов, снижение железо-индуцированного окислительного стресса / ферроптоза, влияние на эндотелиальную дисфункцию при метиониновой нагрузке);

– каков вклад каждого компонента солезаменителя (калий/магний/кальций и органические анионы) и существует ли доза-эффект;

– воспроизводимы ли эффекты на расширенной выборке с учетом коррекции на множественные сравнения;

– сохраняются ли улучшения при более длительном наблюдении и как они соотносятся с морфологическими изменениями органов (включая количественную оценку отложения железа и воспалительных изменений);

– насколько результаты транслируемы к популяциям с различным риском гиперкалиемии, учитывая, что международные рекомендации по применению ГНСЗ предполагают исключение лиц с нарушенной экскрецией калия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Так называемые «солевые эксцессы» и следующие за ними тяжелые гипертонические кризы чаще наблюдаются у пациентов, которые долго находились на низкосолевой диете. Поэтому вполне обосновано появление разработок по созданию пищевых добавок, заменяющих поваренную соль, которые благодаря своим органолептическим свойствам могли бы улучшить переносимость гипонатриевой диеты (в т.ч. устранить стрессирующий фактор абстиненции, нивелирующий положительные эффекты гипонатриевых диет, корригировать электролитные и метаболические нарушения у пациентов с АГ). Целесообразность применения солезаменителей определяется уменьшением отрицательных последствий избыточного поступления хлорида натрия.

В настоящей работе изучены эффекты ГНСЗ с оптимизированным ионным составом на модели ускоренного «диетарного» старения у белых крыс, вызванного D‑галактозой в сочетании с пальмовым маслом, L-метионином в диете, хлоридом натрия в питьевой воде и сульфатом железа. При воспроизведении модели отмечено повышение уровней креатинина в сыворотке на фоне достоверного снижения СКФ. ГНСЗ способствовал восстановлению данных показателей в сторону значений, нормальных для интактных животных.

Полиорганные поражения, возникающие при воспроизведении модели, также затрагивали состояние и биосинтетическую функцию печени и отчасти компенсировались ГНСЗ (нормализация коэффициента насыщения трансферрина железом, уровней натрия, магния и калия в сыворотке крови). Терапия приводила к ослаблению хронического воспаления (нормализация уровней лейкоцитов, в т.ч. нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов). Воспроизведение модели ускоренного старения приводило к падению фракции незрелых ретикулоцитов, а применение ГНСЗ позволяло достичь значений этих показателей, достоверно не отличавшихся от значений для интактных животных.

Результаты неврологического тестирования животных, проведенного с использованием методики «открытое поле» и теста Порсолта, показали, что возникающие при воспроизведении модели неврологические нарушения успешно компенсировались c использованием терапии препаратом. Таким образом, ГНСЗ не только является эффективным заменителем соли, но и проявляет некоторые геропротекторные эффекты.