Маркеры нейтрофильных внеклеточных ловушек как индикаторы тяжести вульвовагинальной атрофии после противоопухолевой терапии

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Вульвовагинальная атрофия (ВВА) является одним из наиболее частых и клинически значимых последствий гипоэстрогенных состояний, включая как естественную постменопаузу, так и искусственную гормональную депривацию после противоопухолевого лечения [1–3]. До 70–90% женщин, перенесших химиолучевую терапию (ХЛТ) или антиэстрогенное лечение, испытывают выраженные симптомы генитоуринарного менопаузального синдрома, включая сухость, жжение, диспареунию, нарушения вагинальной экосистемы и эпителиальную атрофию [4]. Эти изменения существенно снижают качество жизни, сексуальное здоровье и нередко оказываются резистентными к стандартной терапии [2][5–8].

Несмотря на клиническую значимость проблемы, механизмы, определяющие персистенцию и тяжесть атрофических изменений после онкотерапии, изучены недостаточно. Традиционно ВВА рассматривается преимущественно как следствие сниженной эстрогенной стимуляции тканей, приводящей к истончению эпителия, снижению васкуляризации, изменению вагинального pH и нарушению микробиоты [9][10]. Однако данные последних лет свидетельствуют о том, что повреждение слизистой после ХЛТ, а также локальное воспаление при антиэстрогенной терапии не могут быть объяснены только дефицитом эстрогенов [11].

Растет интерес к роли врожденного иммунитета, в частности активации нейтрофилов, в патогенезе атрофических и воспалительных изменений слизистых [12]. Нейтрофильные внеклеточные ловушки (англ. neutrophil extracellular traps, NETs), содержащие цитруллинированные гистоны H3 (англ. citrullinated histone H3, CitH3), миелопероксидазу (англ. myeloperoxidase, MPO) и сериновые протеазы, включая катепсин G (англ. cathepsin G, CatG), играют центральную роль в повреждении эпителия, усилении микрососудистой дисфункции и поддержании хронического воспаления. NETs широко изучены при поражении слизистых кишечника, респираторного и урогенитального тракта, однако данных об их роли при ВВА фактически нет [13–16].

Особое значение NETs могут иметь у женщин, перенесших ХЛТ, поскольку радиация и цитотоксические методы лечения вызывают выраженный выброс внеклеточных ловушек, усиливая локальное воспаление, нарушая репарацию тканей и снижая функциональную регенерацию эпителия. Антиэстрогенная терапия также ассоциирована с повышенной активацией нейтрофилов и усилением продукции провоспалительных цитокинов, что может способствовать NETs-опосредованному повреждению слизистой [17]. Эти данные формируют предпосылки для изучения NETs как возможного звена патогенеза ВВА.

Цель – оценить уровень NETs-маркеров (CitH3, MPO, CatG) в крови при различных фенотипах ВВА после противоопухолевой терапии и определить их значение как потенциальных биомаркеров тяжести атрофии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Дизайн исследования / Study design

Проведено поперечное сравнительное исследование с включением пяти групп (от здоровых постменопаузальных женщин до различных фенотипов ВВА, в т.ч. ВВА после противоопухолевой терапии) с оценкой уровней ключевых NETs-маркеров.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Использовали следующие критерии включения:

– женский пол;

– возраст 40–70 лет;

– наличие в анамнезе противоопухолевого лечения (соответственно группе);

– подтвержденная по шкале атрофии, клиническим симптомам и данным осмотра ВВА;

– согласие на участие и подписание информированного добровольного согласия.

Критерии исключения:

– текущая инфекция половых путей до терапии;

– аутоиммунные и системные воспалительные заболевания;

– тяжелые сопутствующие болезни в фазе декомпенсации;

– прием системной гормональной терапии в последние 3 мес (кроме антиэстрогенной терапии в 3‑й группе);

– онкологический рецидив или прогрессирование опухоли.

Группы обследованных / Study groups

Участвовавшие в исследовании женщины в постменопаузе были разделены на пять групп:

– с ВВА после радикального хирургического лечения (1-я группа, n=52);

– с ВВА после ХЛТ (2-я группа, n=27);

– с ВВА на фоне антиэстрогенной терапии (3-я группа, n=48);

– с ВВА без онкологического анамнеза (4-я группа, n=53);

– контрольная группа – без ВВА и онкологического анамнеза (5-я группа, n=35).

Во всех группах проводили оценку клинического состояния, вагинального рН, индекса вагинального здоровья (англ. vagina health index, VHI), а также выполняли забор венозной крови для определения биомаркеров NETs.

Клиническое обследование / Clinical examination

Клиническое состояние

Клиническое состояние пациенток оценивали в ходе очного визита, включавшего следующие опции:

– сбор жалоб с использованием стандартизированного перечня симптомов ВВА (сухость влагалища, жжение, зуд, диспареуния, дизурические явления, снижение эластичности тканей, чувство стянутости или дискомфорта в покое);

– анализ акушерско-гинекологического анамнеза;

– оценка онкологического анамнеза (тип противоопухолевой терапии, сроки, дозы);

– оценка выраженности симптомов (сухость влагалища, диспареуния, жжение/дискомфорт во влагалище) по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) от 0 до 10 баллов¹;

– оценка менопаузального статуса, длительности гипоэстрогенного периода;

– гинекологический осмотр на кресле с оценкой цвета слизистой, степени истончения эпителия, наличия микротрещин, субэпителиальных петехий, воспалительных изменений.

Оценку толщины слизистого слоя влагалища выполняли с использованием трансвагинального датчика частотой 5–9 МГц на ультразвуковом аппарате Voluson E8 (GE Healthcare, США).

Степень выраженности ВВА определяли на основании объективных признаков атрофии слизистой влагалища, включая состояние и толщину эпителия, выраженность складчатости, влажность, цвет слизистой, эластичность тканей и наличие контактной ранимости. В соответствии с выраженностью указанных признаков пациенток относили к категориям: норма, легкая, умеренная, умеренно-тяжелая или тяжелая атрофия.

Все данные фиксировали в индивидуальной регистрационной карте.

Оценка рН влагалища

Определение влагалищного рН проводили с помощью индикаторных pH-полосок с диапазоном 3,0–8,0. Оценку окраски выполняли в соответствии с цветовой шкалой производителя. Перед исследованием исключали введение любого геля, свечи, крема (отмена более чем за 24 ч).

Нормальный pH влагалища у репродуктивных женщин составляет 3,5–4,5 за счет лактобацилл и выработки молочной кислоты. У постменопаузальных женщин без ВВА pH может быть немного выше – до 5,0, но остается стабильным и не сопровождается атрофией. Повышение влагалищного pH трактовали как маркер гипоэстрогенного состояния: pH≥5,0 считали повышенным, pH≥5,5 – клинически значимым и соответствующим выраженной ВВА и нарушению вагинальной экосистемы.

Оценка VHI

Индекс ВВА определяли с помощью валидированной шкалы VHI. Показатель включает пять параметров, каждый оценивается от 1 до 5 баллов:

– эластичность слизистой;

– степень увлажненности;

– целостность эпителия / отсутствие петехий и микротрещин;

– вагинальная секреция (количество и характер);

– pH влагалища.

Интерпретация VHI: ≤15 баллов – выраженная атрофия, 16–20 баллов – умеренная атрофия, >20 баллов – минимальные атрофические изменения. Суммарный показатель VHI рассчитывали как сумму баллов по всем пяти параметрам (диапазон 5–25 баллов) и использовали как основной клинический показатель тяжести атрофии и для сравнения между группами.

Лабораторные методы / Laboratory methods

Для исследования маркеров NETs использовали венозную кровь, полученную из периферической вены натощак между 08:00 и 11:00.

В исследовании использовали плазму, стабилизированную K₂-EDTA². Данный тип образца является предпочтительным для анализа маркеров NETs, включая MPO-антиген, поскольку исключает искусственное высвобождение MPO при свертывании крови, характерное для сыворотки. Для каждой участницы забирали 6 мл венозной крови в вакуумную пробирку с K₂-EDTA. Исследование проводили в плазме, полученной по протоколу двойного центрифугирования.

Концентрацию CitH3 измеряли методом сэндвич-иммуноферментного анализа с использованием набора CitH3 (Clone 11D3) ELISA Kit (Cayman Chemical, США), каталожный номер 501620; референсные значения 0–5,00 нг/мл.

Определение MPO выполняли с помощью тест-систем MPO Human ELISA Kit (Hycult Biotech, Нидерланды), каталожный номер HK324; нормативные значения (здоровая взрослая популяция) 2,23–2,89 нг/мл.

Уровень CatG определяли с использованием коммерческого набора AssayMax Human Cathepsin G ELISA Kit (AssayPro, США), каталожный номер EC3237-1; диапазон измерений 0,30–20,00 нг/мл. Валидированные референсные значения CatG для сыворотки крови в настоящее время не установлены, в связи с чем интерпретацию результатов проводили на основании межгрупповых сравнений.

Статистический анализ / Statistical analysis

Анализ полученных данных выполняли с помощью программного обеспечения StatTech версии 4.8.5 (ООО «Статтех», Россия). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро–Уилка. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [ Q1–Q3]). Для попарного сравнения количественных показателей между группами использовали критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони (критический уровень значимости после коррекции p<0,005). В качестве меры эффекта рассчитывали коэффициент r (r = Z / √N), интерпретируя его как малый (r≈0,10–0,29), средний (r≈0,30–0,49) и крупный (r≥0,50).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Общая характеристика пациенток / Patient general characteristics

Клиническая характеристика пациенток представлена в таблице 1. Наблюдалось последовательное нарастание выраженности атрофических изменений от группы физиологического контроля к женщинам после онкологического лечения.

Пациентки после ХЛТ демонстрировали наиболее щелочной вагинальный рН, минимальные значения VHI и наибольшее истончение эпителия, что сопровождалось максимальной частотой наличия микротрещин и выраженностью субъективных симптомов. У женщин после антиэстрогенной терапии и хирургической менопаузы данные показатели занимали промежуточное положение, тогда как при ВВА без онкологического анамнеза изменения соответствовали «чистой» гипоэстрогении (показатели контрольной группы). Клинические данные отражают четкую зависимость тяжести атрофии от характера перенесенной терапии.

Маркеры NETs / NET biomarkers

Определение концентраций CitH3, MPO и CatG в крови у пациенток исследуемых групп (табл. 2) показало, что максимальная NETs-активация наблюдается при тяжелом повреждении тканей (ХЛТ), умеренная – при хронической эстрогенной депривации, связанной с лечением гормонозависимых опухолей, и минимальная – при физиологической постменопаузальной гипоэстрогении без дополнительных повреждающих факторов.

Межгрупповой анализ показал, что наиболее выраженные различия уровней CitH3, MPO и CatG наблюдаются между пациентками с ВВА при онкологических заболеваниях (особенно после ХЛТ и на фоне антиэстрогенной терапии) и постменопаузальными женщинами без ВВА, с крупным размером эффекта (r≥0,5) для всех маркеров. Различия между хирургической менопаузой и ВВА без онкоанамнеза носили крупный размер эффекта для CitH3 и MPO и средний – для CatG, тогда как между ХЛТ и антиэстрогенной терапией значимо отличались только уровни MPO, а профили CitH3 и CatG были сопоставимы (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

В нашем исследовании впервые проведен комплексный анализ маркеров NETs (CitH3, MPO, CatG) у женщин с разными фенотипами ВВА, формирующейся после различных видов противоопухолевой терапии. Полученные данные демонстрируют четкую градацию NETs-активации в зависимости от степени повреждения слизистой и характера перенесенного лечения: максимальный иммуновоспалительный ответ наблюдается после ХЛТ, выраженные изменения – при антиэстрогенной терапии, умеренные – после радикального хирургического лечения, минимальные – при ВВА без онкологического анамнеза. Контрольная группа демонстрировала физиологически низкие уровни NETs-маркеров.

Эти результаты поддерживают концепцию, согласно которой NETs являются чувствительными биомаркерами хронического микрососудистого повреждения, локального воспаления и нарушенной репарации, лежащих в основе ВВА в условиях онкологического анамнеза. Полученные данные перекликаются с современными представлениями о роли нетоза в повреждении слизистых оболочек различной локализации, включая кишечник, полость рта и респираторный тракт [12][18][19].

Роль NETs в патогенезе повреждения слизистых структур хорошо подтверждена в исследованиях других локализаций [20]. Однако существует лишь ограниченное число работ, рассматривающих NETs в контексте генитального тракта [21][22]. В основном NETs изучены при хроническом вагините, бактериальном вагинозе, воспалительных состояниях генитального тракта и при раневом процессе слизистых оболочек [16][23]. Показано, что CitH3 и MPO являются наиболее чувствительными маркерами активации NETs, отражающими степень локального воспаления. Большинство публикаций, посвященных ВВА и генитоуринарному менопаузальному синдрому, рассматривают состояние преимущественно через призму эстрогенной депривации, анатомо-гистологических изменений и микробиоты [10], но не затрагивают иммунологическую природу ВВА. Даже работы, изучающие ВВА у женщин после рака молочной железы, фокусируются в первую очередь на проблемах выбора безопасной терапии [24][25], а не на механизмах, приводящих к повреждению слизистой. В нашем исследовании показано, что даже ВВА без онкоанамнеза сопровождается умеренной NETs-активацией, что соответствует данным о роли локального воспаления при естественной гипоэстрогении [5]. Однако у пациенток после противоопухолевой терапии NETs-ответ был значительно выше, что подчеркивает влияние внешних повреждающих факторов [26–29].

Международные данные подтверждают, что лучевая терапия вызывает мощный NETs-ответ. В исследованиях на моделях кишечной и вагинальной слизистой показано, что радиация индуцирует выброс MPO, нейтрофильной эластазы и CitH3, способствуя хроническому воспалению, эпителиальной атрофии и ухудшению репарации [30][31]. Кроме того, NETs усиливают эндотелиальную дисфункцию и нарушают микроциркуляцию, что также описано в контексте радиационного повреждения тканей. Наши данные согласуются с этими результатами: максимальная выраженность NETs-ответа выявлена при наиболее тяжелом повреждении (радиационное воздействие), что соответствует универсальной закономерности «чем сильнее повреждение ткани – тем выше уровень NETs».

Антиэстрогенная терапия (ингибиторы ароматазы, тамоксифен) сопровождается глубоким снижением уровня эстрогенов и развитием хронического локального воспаления. Есть работы, в которых показано, что эстрогенная депривация увеличивает активацию NETs [32] через усиление продукции интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) [33], что приводит к ухудшению состояния вагинальной слизистой у выживших после рака молочной железы. Наши данные о значительной NETs-активации при антиэстрогенной терапии полностью соответствуют этим наблюдениям.

Перспективы терапии / Prospects for therapy

С учетом выявленного повышения CatG, MPO и CitH3 перспективными представляются таргетные противовоспалительные средства, ориентированные на конкретные иммуновоспалительные фенотипы ВВА.

Антиоксидантная терапия

Антиоксидантная терапия направлена на снижение активных форм кислорода (АФК) и подавление формирования NETs. ХЛТ индуцирует выраженный окислительный стресс, являющийся ключевым триггером NETs-активации. Антиоксиданты могут снижать образование АФК, уменьшать нетоз и способствовать восстановлению эпителиального барьера [34–36].

Перспективные агенты:

– N-ацетилцистеин уменьшает нетоз и производство MPO;

– мелатонин снижает окислительный стресс и стимулирует репарацию;

– витамин D подавляет нейтрофильную активацию;

– полифенолы (ресвератрол, эпигаллокатехин) обладают анти-NETs свойствами.

Особенно полезна такая терапия при фенотипах ВВА после ХЛТ и антиэстрогенов (максимальная NETs-активация).

Ингибиторы нетоза и сериновых протеаз нейтрофилов

Эти таргетные средства, направленные на нейтрофильные протеазы или процесс нетоза, могут уменьшать воспаление и улучшать репарацию [37][38].

Перспективные подходы:

– PAD4-ингибиторы блокируют цитруллинирование гистонов и образование NETs;

– локальная или системная дезоксирибонуклеаза I расщепляет внеклеточную ДНК NETs;

– колхицин в низких дозах подавляет формирование NETs в экспериментальных моделях;

– босвеллия (Boswellia serrata) является натуральным ингибитором CatG, нейтрофильной эластазы и ядерного фактора каппа В;

– ингибиторы нейтрофильной эластазы разрабатываются для мукозитов и воспаления слизистых.

Особенно полезна такая терапия при ХЛТ (высокие уровни MPO, CitH3, CatG), антиэстрогенных формах ВВА.

Локальная противовоспалительная и репаративная терапия

Высокие уровни MPO и CatG указывают на выраженное локальное воспаление, что оправдывает применение средств, улучшающих репарацию и уменьшающих повреждение эпителия [39]. Учитывая, что сериновые протеазы нейтрофилов (нейтрофильная эластаза, CatG) – ключевые медиаторы воспалительного повреждения кожи, которые участвуют в патогенезе заболеваний, таких как псориаз, и что ингибирование этих протеаз в доклинических моделях (например, с помощью сивелестата) [40] приводит к выраженному снижению воспаления, уменьшению гиперплазии эпидермиса и улучшению гистологической картины, представляется логичным рассмотреть топические антипротеазы как перспективные средства для снижения NETs-опосредованного повреждения эпителия слизистой [41].

В дополнение, учитывая репаративные свойства гелей с гиалуроновой кислотой и декспантенолом, а также хорошо зарекомендовавших себя противовоспалительных и антибактериальных кремов на основе метронидазола или клиндамицина (например, при розацеа, вагинитах), можно выдвинуть гипотезу, что комбинированные схемы (ингибиторы сериновых протеаз + репаративный/антибактериальный гель) могут быть эффективны для восстановления слизистой и эпителия, снижения воспаления.

Перспективные средства:

– гели с гиалуроновой кислотой и декспантенолом;

– топические антипротеазы (ингибиторы CatG / нейтрофильной эластазы);

– краткие курсы локальных стероидов при выраженном воспалении;

– противовоспалительные кремы на основе метронидазола, клиндамицина;

– анти-ФНО-α кремы.

Особенно полезна такая терапия при ХЛТ (стойкая воспалительная атрофия), антиэстрогенной терапии (хроническое воспаление, сухость, микротрещины).

Восстановление влияния эстрогенов

Эстрогены подавляют нетоз, улучшают микроциркуляцию и восстанавливают эпителий [42][43].

Варианты терапии:

– локальные эстрогены;

– вагинальный дегидроэпиандростерон (прастерон) безопаснее при онкологическом анамнезе [44];

– оспемифен (системный) разрешен многим выжившим после рака молочной железы) [45][46];

– лазерная/радиочастотная терапия улучшает ангиогенез и является промоутером синтеза коллагена [47].

Особенно полезна такая терапия при хирургической менопаузе, ВВА без онкологических анамнезов, антиэстрогенных формах (при оцененной онкобезопасности альтернативных методов).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Наши результаты впервые показывают, что наиболее выраженные изменения в уровне биомаркеров NETs выявлены у женщин после ХЛТ. Антиэстрогенная терапия сопровождается сочетанием эстрогенной депривации и усиления нетоза. Хирургическая менопауза характеризуется умеренной NETs-активацией. Даже при отсутствии онкологического анамнеза ВВА не является полностью «неиммунным» состоянием, о чем свидетельствуют умеренно повышенные относительно значений контрольной группы уровни NETs-маркеров.

Эти данные указывают на то, что ВВА после различных видов противоопухолевой терапии – это не единое состояние, а набор иммуновоспалительных фенотипов, каждый из которых требует дифференцированного, патогенетически обоснованного подхода к терапии. NETs-маркеры потенциально могут служить инструментом стратификации пациенток, прогнозирования резистентных форм атрофии и выбора оптимальной комбинации терапевтических подходов, включая антиоксиданты, модуляторы воспаления, препараты, влияющие на NETs, локальные средства для восстановления микроциркуляции и эпителиальной регенерации, а также альтернативные методы восстановления у женщин с онкологическим анамнезом.