Изучение влияния стандартизированных омега-3 полиненасыщенных жирных кислот на показатели полиорганной патологии в экспериментальной модели старения

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Обеспеченность организма омега-3 полиненасыщенными жирными кислотами (ω3-ПНЖК) – важный фактор соматического здоровья. Микронутриентные и фармацевтические препараты на основе ω3-ПНЖК широко используются для кардиопротекции (профилактика атеросклероза, эндотелиальной дисфункции, хронического воспаления, избыточного тромбообразования), нейропротекции, гепатопротекции, поддержки иммунитета и т.д. [1]. К настоящему времени получен комплекс научных данных, указывающих на важную роль ω3-ПНЖК в противодействии патофизиологии старения тканей различных органов.

Показаны эффекты ω3-ПНЖК на старение печени. На клеточном уровне старение гепатоцитов связано с накоплением повреждений ДНК, митохондриальной дисфункцией и активацией маркеров клеточной сенесценции p16 и p21. Такие ω3-ПНЖК, как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и докозагексаеновая кислота (ДГК), имеют большое значение для поддержания функции печени и замедления старения гепатоцитов, способствуя повышению длительности их жизни [2]. Посредством активации рецептора, активируемого пероксисомным пролифератором альфа (англ. рeroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα), регулирующего углеводный/жировой обмен и воспаление, ω3-ПНЖК (особенно ЭПК) способствуют улучшению энергетического метаболизма гепатоцитов, увеличивая бета-окисление жирных кислот и продукцию аденозинтрифосфата (АТФ), что замедляет возрастные изменения и предотвращает развитие неалкогольной жировой болезни печени [3].

Положительное воздействие ω3-ПНЖК на печень связано еще и с тем, что они способствуют поддержке гомеостаза железа (ингибируя как перегрузку железом, так и формирование дефицита железа в тканях). Поэтому ω3-ПНЖК могут тормозить железозависимую форму апоптоза (ферроптоз) гепатоцитов [4]. Кроме того, поддерживая метилирование ДНК [5] (что важно для регуляции экспрессии генов и эпигенетического наследования), ω3-ПНЖК напрямую способствуют замедлению старения геномной ДНК.

Молекулярные механизмы нефропротекторного действия ω3-ПНЖК также основаны на сокращении воспаления, в т.ч. на экспрессии провоспалительных цитокинов – фактора некроза опухоли альфа и интерлейкина-6 (ИЛ-6), на снижении окислительного стресса и поддержке энергетического метаболизма. Увеличивая бета-окисление жирных кислот и продукцию АТФ (через рецептор PPARα), ω3-ПНЖК способствуют улучшению энергетического обмена нефроцитов, что важно для торможения возрастных изменений (снижение функции почек, фиброз) [3]. Замедляя развитие нарушений обмена железа, ω3-ПНЖК предотвращают перегрузку почек железом, характерную для хронической болезни почек [4].

Омега-3-ПНЖК обладают выраженными кардиопротекторными свойствами посредством разрешения воспаления (в т.ч. через ингибирование эффектов провоспалительных эйкозаноидов, биосинтез молекул резолвинов, маресинов, нейропротектинов) и через активацию сигнального пути AMPK¹, участвующего в поддержке энергетического гомеостаза кардиомиоцитов [6]. Многочисленные доказательные исследования продемонстрировали, что дотации стандартизированных форм ω3-ПНЖК снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклероз и инфаркт миокарда [7].

Доказано, что ω3-ПНЖК (особенно ДГК) являются ключевыми компонентами мембран нейронов и играют важную роль в нейропротекции при старении мозга, снижая нейровоспаление (в т.ч. продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6), поддерживая митохондриальную функцию [8], биосинтез нейропротектинов, экспрессию генов нейротрофических факторов (в частности, BDNF²) и синаптическую пластичность [9]. Клинические данные подтверждают, что дотации ω3-ПНЖК улучшают когнитивные функции и сохраняют объем мозга у пожилых [10].

Омега-3 ПНЖК оказывают положительное влияние на здоровье кожи, улучшая ее гидратацию, снижая выраженность морщин и защищая от ультрафиолетового старения [11]. Механизмы воздействия ω3-ПНЖК на состояние кожи включают ингибирование синтеза провоспалительных медиаторов и поддержку барьерной функции кожи (в т.ч. посредством усиления экспрессии филаггрина) [12]. Топическое применение ω3-ПНЖК в составе косметических средств способствует улучшению состояния кожи [13].

Эффективность препаратов ω3-ПНЖК определяется их жирнокислотным составом: прежде всего, количествами ЭПК, ДГК и других видов ненасыщенных и насыщенных жирных кислот. Исследование жирнокислотного состава 16 препаратов ω3-ПНЖК позволило получить высокоинформативные фармакомаркеры качества жирнокислотного состава, с помощью которых можно достоверно отделять препараты с высокой степенью стандартизации по ω3-ПНЖК (NFO^® Омега-3 Премиум, NFO^® Omega-3 Strong DHA, NFO^® Омега-3 Ультима и др.) от менее стандартизированных препаратов [14].

В настоящей работе эти фармацевтически стандартизированные формы ω3-ПНЖК апробированы на комплексной «диетарной» модели ускоренного старения на основе D-галактозы. В экспериментальной фармакологии широко используется модель ускоренного старения у крыс, вызванная перегрузкой организма D-галактозой, которая снижает активность антиоксидантных ферментов и проявляет другие патофизиологические эффекты. При использовании D-галактозы (150 мг/кг/сут, 12 нед) у крыс наблюдается картина старения, сопровождаемая изменениями в функционировании обонятельной системы, коры головного мозга, гипокампа и гипоталамуса на фоне отклонений в обработке социально значимой запаховой информации [15].

Цель – изучение эффектов приема стандартизированных ω3-ПНЖК на модели ускоренного «диетарного» старения, вызванного D-галактозой в сочетании с пальмовым маслом, L-метионином в диете, хлоридом натрия в питьевой воде и сульфатом железа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Экспериментальные животные / Experimental animals

Исследование было выполнено на 72 крысах-самцах линии Wistar массой 300–500 г, которые были распределены на шесть групп так, чтобы индивидуальное значение массы тела не отклонялось от среднего по группе более чем на 20%. Взвешивание осуществляли на электронных весах для взвешивания крыс/мышей (Cas Corporation, Россия).

В первой группе (n=12, интактный контроль, возраст 3,5 мес) животные получали нормальную диету и питье в виде чистой питьевой воды. Во второй группе (n=12, естественное старение, возраст более 1 года) крысы также получали нормальную диету и питье в виде чистой питьевой воды. В третьей (n=12), четвертой (n=12), пятой (n=12) и шестой группах (n=12) возраст животных составлял 3,5 мес и воспроизводилась модель старения.

Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с СП 2.2.1.3218-14³ (в поликарбонатных клетках, группами одного пола (самцы), на подстилке, клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением). В качестве подстилки использовались опилки. Корм для содержания лабораторных животных ЛБК-120 (АО «БиоПро», Россия), приготовленный по ГОСТ Р50258-92⁴, давался ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Данные о составе и качестве корма от производителя хранились в документации лаборатории и в файле исследования. В группе интактных контролей животным вода давалась ad libitum в стандартных поилках со стальными крышками-носиками (ГОСТ Р 51232-98⁵).

Соблюдались контролируемые условия окружающей среды (температура 18–26 °C, относительная влажность воздуха 30–70%). В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения. Контроль условий окружающей среды осуществлялся комбинированным измерителем Testo (TestoAG, Германия) и фиксировался в соответствующем журнале. Для акклиматизации лабораторные крысы до начала исследования содержались 5 дней в одиночных клетках. Во время этого периода у них ежедневно контролировалось клиническое состояние путем визуального осмотра. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями не были включены в экспериментальные группы.

Модель ускоренного старения / Accelerated aging model

В нашей работе D-галактозная модель старения была усилена компонентами диеты, вызывающими и старение тканей, и полиорганную патологию (пальмовое масло, L-метионин, натрия хлорид, сульфат железа).

Модель старения воспроизводили следующим образом: в течение 12 сут животным включали в питание пальмовое масло в дозе 30 г/кг/сут (CandleM, Индонезия), крыс зондировали раствором L-метионина (САS 63-68-3, ServiceB1io) в дозе 0,15 г/кг/сут per os, раствором D-галактозы (САS 59-23-4, Himedia) в дозе 0,5 г/кг/сут, а для свободного питья предоставляли 1% раствор хлорида натрия. Железо сернокислое (АО «ЛенРеактив», Россия, паспорт № 070051-81) в дозе 25 мг/кг/сут вводили внутрибрюшинно.

Разработанная модель ускоренного старения ориентирована на реалистичное моделирование нарушений диеты, которые повсеместны для различных популяций человека, в т.ч. в пожилом возрасте. Так, перегрузка D-галактозой нарушает углеводный обмен и ускоряет нейродегенеративные изменения мозга, характерные для пожилого возраста. Перегрузка хлоридом натрия соответствует формированию солезависимых форм артериальной гипертонии. Перегрузка насыщенными жирами пальмового масла создает условия для атерогенеза сосудов и дисфункции печени. Нарушения печени усиливаются вследствие перегрузки метионином, трансформирующейся в избыток гомоцистеина (особенно на фоне дефицита потребления фолатов), вызывая эндотелиальную дисфункцию. Перегрузка железом усиливает эндотелиопатию, атерогенез, нарушения функции печени, также стимулируя развитие полиорганных поражений, характерных для пожилого возраста.

Препараты ω3-ПНЖК / ω3-PUFA preparations

В исследовании использовались фармацевтически стандартизированные формы ω3-ПНЖК производства компании NFO:

– NFO^® Омега-3 Ультима (свидетельство о государственной регистрации AM.01.48.01.003.R.000200.08.20);

– NFO^® Omega-3 Strong DHA (свидетельство о государственной регистрации AM.01.07.01.003.R.001255.08.23);

– NFO^® Омега-3 Премиум (свидетельство о государственной регистрации AM.01.01.01.003.R.000582.09.24).

Ход эксперимента / Experimental process

Через 13 дней от начала эксперимента крысам первой (интактные), второй (естественное старение) групп и половине третьей группы (контроль без лечения) вводили наркозное средство (золетил), забирали кровь для биохимического анализа и секционный материал (печени, почек, мозга, сердца, кожи) для патоморфологического анализа. Остальных крыс переводили на нормальную диету и обычный питьевой режим. С 13-го дня исследования в третьей группе (n=6) животные медикаментозного лечения не получали.

В остальных группах одновременно с пищей крысам вводили препараты ω3-ПНЖК в дозе 30 мг/кг/сут per os в течение 40 дней:

– в четвертой группе (n=6) – NFO^® Омега-3 Ультима;

– в пятой группе (n=6) – NFO^® Omega-3 Strong DHA;

– в шестой группе (n=6) –NFO^® Омега-3 Премиум.

Животных наблюдали до 54-го дня эксперимента. На 54-й день крыс третьей, четвертой, пятой и шестой групп наркотизировали, забирали кровь для биохимического анализа и секционный материал (печени, почек, мозга, сердца, кожи) для патогистологического изучения.

Оцениваемые показатели / Evaluated indicators

Наблюдения за животными проводили ежедневно. Фиксировали общее состояние, аппетит, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, частоту и глубину дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покровов, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс. На 0-й, 13-й, 54-й дни определяли показатели, перечисленные в таблице 1.

Патогистологическое исследование секционного материала / Pathohistological examination of sectional material

На 13-й и 54-й дни исследования животных выводили из эксперимента путем достижения наркозной смерти с использованием золазепама (Золетил^®, Virbac, Франция). Посредством краниотомии головной мозг извлекали целиком и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут с помощью фронтальных разрезов выделяли зону прецентральной извилины переднего мозга, мозжечок, ствол головного мозга.

После эвисцерации сердце, печень, почки и фрагменты кожного покрова фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут ткани препарировали, выделяли фрагменты миокарда левого желудочка, правой и левой долей печени, кортикальные отделы правой и левой почек, которые повторно фиксировали. После вторичной фиксации и промывки материала проводку (обезвоживание) тканей головного мозга, печени и почек осуществляли с помощью 99% изопропилового спирта. В дальнейшем кусочки заливали парафином и изготовленные на санном микротоме Microm^® HM 325 (Thermo Fisher Scientific Microm International GmbH, Германия) гистологические срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Дубликаты срезов с помощью набора реактивов (ООО «БиоВитрум», Россия) окрашивали по Перльсу для выявления в тканях трехвалентного железа. Результатом проведенной реакции должно быть образование окрашенной в синий цвет соли – берлинской лазури.

Представление данных / Data presentation

Разработанная модель старения, также как и применение ω3-ПНЖК, одновременно стимулируют сложные, взаимосвязанные изменения значений многих биохимических и неврологических показателей состояния животных. Поэтому для полноценного описания результатов настоящей работы использованы особые формы представления данных, развиваемые в топологическом подходе к распознаванию [16]:

– профиль-диаграммы нормализованных значений всех исследованных показателей;

– интегральные оценки состояния животных.

Профиль-диаграммы позволяют целостно описывать динамику и различия между группами, формировать и оценивать интегральные оценки (баллы) состояния групп животных в различные моменты времени. Как и в работе [16], для построения таких диаграмм необходимо сначала вычислить эмпирические функции распределения (э.ф.р.) каждого из исследованных показателей. Напомним, что э.ф.р. F(X) значений показателя Х – это функция в диапазоне значений [0…1], на графике которой по оси Х отложены наблюдаемые во всех экспериментах значения показателя Х (например, ферритина), а по оси Y – вероятность того, что значение Х меньше заданного. Затем значения показателей в их общепринятых единицах измерения заменяются на значения э.ф.р. в безразмерных единицах в диапазоне значений [0...1]. После этого значения показателей в их общепринятых единицах измерения (например, мкг/л для ферритина) заменяются на значения э.ф.р. в безразмерных единицах в диапазоне значений [0...1]. Использование значений э.ф.р. вместо исходных значений показателей позволяет наглядно сравнивать эффекты различных терапевтических воздействий в единой шкале.

Для введения интегральных (балльных) шкал вычисляются э.ф.р. каждого из исследованных показателей. Далее значения показателей в их естественных единицах измерения (например, ммоль/л) заменяются на значения э.ф.р. в безразмерных единицах в диапазоне значений [0...1]. Затем определяются знаки позитивных и негативных изменений показателей. Для этого сравниваются значения одного и того же показателя в интактной группе и при воспроизведении модели заболевания. Принимается, что изменения всех показателей при воспроизведении модели соответствуют активации патофизиологических процессов и, соответственно, носят негативный характер. Тогда отрицательный знак разности значений «значение (интактные) – значение (модель)» соответствует возрастанию показателя при воспроизведении модели, а положительный знак разности – уменьшению показателя при воспроизведении модели. Например, уровни аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) возрастают, поэтому им соответствует отрицательное значение знака разности значений. Соответственно, чем выше значение АСТ/АЛТ, тем более патологично состояние.

Наконец, проводится домножение значения э.ф.р. показателя (в среднем по группе или для индивидуального животного) на знак изменения показателя и суммирование общего балла по всем показателям. Например, знак изменения показателя отрицательный для АСТ/АЛТ и положительный, скажем, для количества эритроцитов – ведь падение числа эритроцитов при воспроизведении модели патологично и соответствует формированию анемии. В результате получается суммарное значение интегрального балла оценки состояния индивидуального животного или группы животных. Более отрицательные значения такой суммы баллов соответствуют более патологическим состояниям, а положительные – физиологическим состояниям.

Комплексные изменения показателей, сопровождающие воспроизведение модели ускоренного «диетарного» старения, обусловили необходимость использования профиль-диаграмм показателей, значения которых были нормализованы на интервал [0…1]. В то время как абсолютные значения исследованных показателей могут отличаться на 1–2 порядка (что не позволяет представить их на одной диаграмме), нормализованные значения позволяют наглядно иллюстрировать изменения.

Например, в нашем исследовании значения ферритина лежали в диапазоне 50–300 мкг/л, а общего билирубина – в диапазоне 0,1–8 мкмоль/л. Диаграмма со столь существенными различиями в порядке значений не будет информативной для читателя, а при нормализации значений уровней ферритина на интервал [0…1] она становится достаточно наглядной.

Таким образом, анализ профилей биохимических показателей, представленных посредством значений э.ф.р., позволяет получить более целостную картину отличий в эффектах исследованных подходов к терапии модели старения, чем использование каких-либо отдельных показателей (АСТ/АЛТ и др.).

Статистический анализ / Statistical analysis

Для изученных показателей проводили подсчет среднего и стандартного отклонения (M±SD). Оценку статистической достоверности осуществляли по критерию Манна–Уитни. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. При необходимости тесты на нормальность распределения выполняли с помощью визуального анализа наблюдаемых и ожидаемых гистограмм распределения данных с подтверждением тестом χ² нулевой гипотезы об отсутствии отличий между наблюдаемым и ожидаемым нормальным распределением (р>0,05). Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США) и таблиц MS Excel (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Результаты исследования для всех групп представлены в виде трех условных сегментов каждой из профиль-диаграмм: профили значений биохимических показателей (рис. 1), профили показателей общего анализа крови (рис. 2) и профили результатов неврологического тестирования (тесты «открытое поле», Порсолта) (рис. 3). Детальный анализ профилей показал, что все изученные препараты ω3-ПНЖК положительно воздействовали на 23 из 55 показателей состояния животных с «диетарной» моделью ускоренного старения (табл. 2).

Общие эффекты ω3-ПНЖК / ω3-PUFA general effects

Омега-3 ПНЖК способствуют торможению деградации ткани печени (снижение уровня витамина В12 до 100±1 пг/мл; контроль: 380,50±29,04 пг/мл; р=0,0005), восстановлению функции печени (повышение абнормально сниженной концентрации прямого билирубина до 1,5±0,1 мкмоль/л; контроль: 0,79±0,40 мкмоль/л; р=0,00363) и уровней фолатов (41,53±6,65 нмоль/л; контроль: 26,82±5,99 нмоль/л; р=0,00123). Они предотвращают резкое падение концентрации железа к 54-му дню (54,52±21,03 мкмоль/л; контроль: 26,98±1,16 мкмоль/л; р=0,01185), замедляют развитие гипернатриемии (125,47±1,16 ммоль/л; контроль: 141,42±1,30 ммоль/л; р=0,0001) и гиперкалиемии (5,83±0,23 ммоль/л; контроль: 7,29±0,05 ммоль/л; р=0,00001).

Все исследованные ω3-ПНЖК, будучи естественными регуляторами процесса разрешения воспаления, способствуют нормализации абнормально повышенного уровня хронического воспаления, связанного с воспроизведением «диетарной» модели. Противовоспалительная активность проявляется как нормализация уровней лейкоцитов (5,13±1,37 10⁹/л; контроль: 9,21±0,40×10⁹/л; р=0,00024), в т.ч. лимфоцитов (2,02±0,54×10⁹/л; контроль: 5,66±0,37×10⁹/л; р=0,0001), эозинофилов (0,06±0,030×10⁹/л; контроль: 0,17±0,01×10⁹/л; р=0,00008) и снижение скорости оседания эритроцитов (16,00±13,25 мм/ч; контроль: 36,50±1,38 мм/ч; р=0,00627).

Все три исследованных препарата ω3-ПНЖК способствовали восстановлению нормального неврологического статуса животных, что проявилось как достоверное увеличение активностей в тестах «открытое поле» и Порсолта. В тесте «открытое поле» применение ω3-ПНЖК приводило к нормализации горизонтальной активности (темные области – 50,00±6,78; контроль: 38,00±5,66; р=0,00399; светлые области – 21,50±6,66; контроль: 9,50±2,17; р=0,00279; общее значение – 69,83±14,41; контроль: 47,17±7,60; р=0,00502), вертикальной активности (стенка – 8,00±1,41; контроль: 5,83±0,75; р=0,0057; на вису – 2,33±0,52; контроль: 1,00±0,63; р=0,00136; общее значение – 10,33±1,75; контроль: 6,83±1,33; р=0,00169), числа обследованных норок (5,33±1,03; контроль: 3,17±0,75; р=0,0012) и случаев короткого груминга (3,17±0,75; контроль: 1,17±0,75; р=0,00049) на фоне снижения общего стресса (болюсы: 4,50±0,84; контроль: 7,00±0,89; р=0,00027).

В тесте Порсолта снизилось общее время неподвижности (138,83±4,54 с; контроль: 182,00±3,58 с; р=0,0001), увеличилось время активного плавания (97,83±1,72 с; контроль: 68,83±2,64 с; р=0,000001) и время борьбы (63,33±3,50 с; контроль: 49,17±1,33 с; р=0,00003).

Таким образом, применение стандартизированных форм ω3-ПНЖК ингибировало неблагоприятные биохимические изменения крови, когнитивный дефицит и подавленность поведения, возникающие при воспроизведении разработанной модели старения у крыс. В клинико-эпидемиологическом исследовании KORA-Age показано, что когнитивные нарушения связаны с низким индексом ω3 в крови у пожилых [17]. Результаты систематического анализа продемонстрировали, что дотации ДГК способствуют поддержке когнитивной функции, особенно в отношении памяти и сохранения объема гиппокампа, на ранних стадиях болезни Альцгеймера [18].

Cпецифические эффекты исследованных препаратов / Specific effects of the studied samples

Выше описаны эффекты всех трех образцов ω3-ПНЖК, без достоверных различий между эффектами препаратов. В то же время изученные образцы проявляли и более специфическое действие, характерное для того или иного конкретного препарата (табл. 3).

Прием NFO^® Омега-3 Ультима способствовал повышению уровней магния (1,16±0,05 ммоль/л; контроль: 1,12±0,01 ммоль/л; р=0,05688 – тренд), специфическому снижению повышенных уровней нейтрофилов (1,39±0,91×10⁹/л; контроль: 2,66±0,70×10⁹/л; р=0,01208), эозинофилов (0,70±0,46%; контроль: 1,80±0,26%; р=0,00052), тромбоцитов (733,00±136,73×10⁹/л; контроль: 844,50±19,36×10⁹/л; р=0,051), что соответствует дополнительным противовоспалительным и антитромботическим эффектам. Восстановление фракции ретикулоцитов средней флюоресценции (22,83±6,42%; контроль: 14,15±3,13%; р=0,00987) соответствует нормализации ранних стадий эритропоэза. Применение NFO^® Омега-3 Ультима приводило к тренду на снижение уровней ферритина (202±38 мкг/л; контроль: 227±14 мкг/л; р=0,065 – тренд). Также повышался длительный груминг животных, что указывает на восстановление их «природной опрятности» (2,17±0,75; контроль: 1,17±0,75; р=0,022).

Ферритин является известным маркером старения. Воспаление, оксидативный стресс и перегрузка железом – характерные процессы патофизиологии старения. Результаты фундаментальных и клинических исследований подтверждают приведенные взаимосвязи и позволяют утверждать, что уровни ферритина в крови характеризуют хронологическое и биологическое старение организма человека [19].

Применение NFO^® Omega-3 Strong DHA приводило к снижению уровней эозинофилов (0,63±0,49%; контроль: 1,80±0,26%; р=0,00053), базофилов (0,43±0,46%; контроль: 0,05±0,05%; р=0,04819) и повышению уровней ретикулоцитов (536,03±272,51×10⁹/л; контроль: 319,15±107,13×10⁹/л; р=0,05785) и процента ретикулоцитов (7,63±4,16%; контроль: 3,90±1,61%; р=0,04145), также способствуя улучшению груминга (2,17±0,75; контроль: 1,17±0,75; р=0,022).

Прием NFO^® Омега-3 Премиум вызывал нормализацию лимфоцитов (40,37±9,21%; контроль: 61,80±7,21%; р=0,00067) и базофилов (0±0×10⁹/л; 0,01±0,01×10⁹/л; р=0,03779), также нормализуя эритроцитогенез (повышение фракции незрелых ретикулоцитов – 40,03±8,25%; контроль: 26,7±0,9%; р=0,00527; увеличение фракции ретикулоцитов средней флюоресценции – 20,03±0,40%; контроль: 14,15±3,13%; р=0,00277; снижение фракции ретикулоцитов низкой флюоресценции – 59,97±7,74%; контроль: 73,25±1,60%; р=0,00387).

Препараты NFO^® Omega-3 Strong DHA и NFO^® Омега-3 Премиум оказывали положительное воздействие на коэффициент вариации распределения эритроцитов, характеризующий разброс размеров эритроцитов. Данный показатель отражает состояние эритроцитогенеза: при возрастании процента слишком малых или, наоборот, слишком больших эритроцитов он увеличивается. У интактных животных значение коэффициента составляло 14,7±0,6% и достоверно увеличивалось при воспроизведении модели старения (15,6±0,7% на 13-й день (р=0,008) и 15,5±0,1 на 54-й день (р=0,0107)). Применение NFO^® Omega-3 Strong DHA сокращало значение показателей до уровней, не отличимых от уровней в группе интактных животных (14,8±0,6%; р=0,0286; контроль: 15,4±0,1%) на 54-й день. Прием NFO^® Омега-3 Премиум также приводил к достоверному снижению коэффициента вариации распределения эритроцитов (14,4±1,2%; р=0,053) по сравнению с контролем на 54-й день.

Таким образом, применение этих двух препаратов ω3-ПНЖК способствовало уменьшению процента избыточно больших (и, наоборот, избыточно малых) эритроцитов. В клинических исследованиях показана взаимосвязь повышенной ширины распределения эритроцитов с ослаблением физической и когнитивной функций у пожилых людей на фоне снижения митохондриальной функции [20].

После проведения терапии посредством исследованных ω3-ПНЖК для ряда параметров не было установлено отличий от значений в группе интактных животных на 54-й день (см. табл. 2, 3). Это отмечено, в частности, для показателей состояния печени (прямой билирубин, фолаты), противовоспалительного действия (лейкоциты, лимфоциты, эозинофилы, скорость оседания эритроцитов) и некоторых неврологических показателей (вертикальная активность на вису и болюсы в тесте «открытое поле», время неподвижности и время борьбы в тесте Порсолта). Таким образом, по этим параметрам состояние животных восстановилось практически до исходного (интактного). Все описанные эффекты указывают на выраженное противодействие всех исследованных ω3-ПНЖК полиорганной дисфункции, связанной с моделью ускоренного «диетарного» старения.

Интегральная балльная оценка эффективности ω3-ПНЖК / Integrated scoring of ω3-PUFA effectiveness

Результаты расчетов интегральной балльной оценки наглядно показывают различия между состоянием животных в группах при воспроизведении модели ускоренного старения и группах, получавших терапию ω3-ПНЖК (рис. 4). Так, для группы интактных крыс значения балла были положительны и составили 9,97±0,56. Воспроизведение модели приводило к резкому снижению значения балла (–7,67±0,80) на 13-й день с некоторой положительной динамикой к 54-му дню (–4,84±1,43; р<0,001).

Прием исследованных форм ω3-ПНЖК приводил к достоверному повышению интегрального балла оценки к 54-му дню (NFO^® Омега-3 Ультима: 0,49±1,31; NFO^® Omega-3 Strong DHA: –1,08±1,66; NFO^® Омега-3 Премиум: –0,64±0,85) без достоверных различий в значениях данного показателя между этими тремя группами.

Таким образом, интегральный балл, включая результаты по всем исследованным показателям, позволяет оценивать общее состояние животных после проведения той или иной терапии и указывает на выраженный терапевтический эффект стандартизированных ω3-ПНЖК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Разработанная модель старения основана на типичных нарушениях диеты, активирующих процессы старения по различным патофизиологическим механизмам (нарушения обмена углеводов, жиров, нейродегенерация, солезависимая гипертония, атерогенез и эндотелиальная дисфункция, поражения печени), что приводит к формированию полиорганной патологии. В работе представлены результаты экспериментальной апробации трех фармацевтически стандартизированных препаратов ω3-ПНЖК (NFO^® Омега-3 Ультима, NFO^® Omega-3 Strong DHA, NFO^® Омега-3 Премиум) на комплексной «диетарной» модели ускоренного старения.

Исследование показало, что применение ω3-ПНЖК комплексно воздействует на существенное количество показателей состояния животных, отражающих различные механизмы старения. Данные препараты способствуют торможению деградации ткани печени и восстановлению ее функции, что проявляется повышением абнормально сниженной концентрации прямого билирубина и нормализацией уровней фолатов. Они предотвращают резкое падение уровней железа, замедляют развитие гипернатриемии и гиперкалиемии. Все исследованные образцы ω3-ПНЖК сокращали абнормально повышенное хроническое воспаление (нормализация уровней лейкоцитов, уменьшение скорости оседания эритроцитов) и способствовали восстановлению нормального неврологического статуса животных (увеличение активностей в тестах «открытое поле» и Порсолта), тем самым тормозя характерное для старения снижение когнитивных способностей.

Таким образом, применение стандартизированных ω3-ПНЖК перспективно для замедления патофизиологии старения.