Нефропротекторные пептиды препарата Лаеннек® в контексте фармакотерапии нефрогепатометаболических нарушений

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Совместные нарушения метаболизма печени и почек существенно утяжеляют состояние пациентов с хронической патологией (сахарный диабет, артериальная гипертония, атеросклероз, остеоартит и др.) и вирусными/бактериальными инфекционными заболеваниями, особенно с затяжным течением. В частности, острая печеночно-почечная недостаточность (ОППН) – функциональное, прогрессирующее, олигурическое, обратимое заболевание почек, которое возникает во время тяжелых заболеваний печени с печеночной недостаточностью. ОППН является одной из наиболее распространенных форм полиорганной недостаточности, отличается характерным повышением уровней мочевины и креатинина в крови и другими метаболическими нарушениями.

Актуальность разработки эффективной и безопасной коррекции нефрогепатометаболических повреждений обусловлена тем, что при совместном нарушении функции печени и почек между этими пораженными органами формируются так называемые порочные круги (включая сосудистый порторенальный рефлекс), приводящие к взаимному ускорению дисфункции обоих органов [1]. В результате частота летального исхода при ОППН в 3 раза выше, чем при изолированном остром поражении печени. От 80% до 90% случаев тяжелой формы ОППН приводит к летальному исходу, что связано с метаболической катастрофой на фоне критического накопления уремических и печеночных токсинов [2]. При этом вследствие большого разнообразия механизмов формирования ОППН смертность не зависит от степени тяжести острого почечного поражения (например, уровня креатинина) [1].

Среди уремических механизмов, повреждающих печень, выделяют метаболический ацидоз, снижение синтеза аргинина с накоплением метаболита – асимметричного диметиларгинина (англ. asymmetric dimethylarginine, ADMA) [3], аккумуляцию индоксилсульфата [4], гиперфосфатемию [5], гиперпродукцию интерлейкина-2 (ИЛ-2) [6]. Иногда ОППН формируется в результате тяжелого кардиогенного шока, при ишемическом поражении почек, остром бактериальном сепсисе, тяжелой ожоговой болезни [7], алкогольном гепатите, стеатогепатите, лекарственном гепатите, тяжелой экзогенной интоксикации (отравление дихлорэтаном, четыреххлористым углеродом, токсином бледной поганки и др.), антифосфолипидном синдроме, тромбофилии, синдроме Бадда–Киари [8], поствакцинальном гепатите [9].

Нефрогепатометаболические нарушения могут быть спровоцированы фульминантной инфекцией (в т.ч. вирусной). Например, для фульминантного вирусного гепатита характерны быстро прогрессирующее течение, высокий уровень смертности и быстрый исход в постнекротический цирроз печени у немногих выживших пациентов. Сочетанные поражения печени и почек часто встречаются у пациентов с острой инфекцией SARS-CoV-2 [10], а субклиническое воспаление и повреждение печени и почек могут сохраняться в течение многих месяцев после формального «выздоровления» пациента с COVID-19 (как компонент так называемого постковидного синдрома) [11].

Очевидно, что для коррекции нефрогепатометаболических нарушений важно использовать фармакотерапию, оказывающую гепатопротекторный и нефропротекторный эффекты. Одним из наиболее перспективных направлений является использование экстрактов природного происхождения. В частности, сочетанный нефрогепатопротекторный эффект установлен для силимарина (растительный экстракт, содержащий флаволигнаны, флавоноиды, полифенолы, жирные кислоты) на модели нефрогепатоинтоксикации салиномицином у кроликов [12] и для экстрактов сердечницы крупковидной (Lepidium draba) на модели нефрогепатоинтоксикации оксиметолоном у крыс [13]. Гепатопротекторное и нефропротекторное действие отмечено при приеме масла семян моринги масличной (Moringa leifera) на модели дихлофос-индуцированной нефрогепатоинтоксикации у крыс [14]. Гиполипидемический, гепатопротекторный и нефропротекторный эффекты подтверждены при применении экстракта айвы продолговатой (Cydonia oblonga mill.) у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином [15].

Для лечения нефрогепатометаболических нарушений перспективно использовать гидролизаты плаценты человека (ГПЧ), характеризующиеся мультимодальным фармакологическим действием. Результаты исследований научной школы В.П. Филатова легли в основу нового направления в фармакологии, связанного с изучением и применением стандартизированных ГПЧ в терапии заболеваний печени, атопического дерматита, вирусных инфекций (вирусного гепатита, герпеса, COVID-19), болезней перегрузки железом и синдрома хронической усталости [16]. ГПЧ Лаеннек^® (Japan Bio Products, Япония), полученный в результате высокотехнологичной переработки тканей плаценты, проявляет противовоспалительное, антиоксидантное действие, уменьшает проявления инсулинорезистентности, фиброза, способствует улучшению показателей липидного обмена и нормализации функции печени. На фоне терапии данным препаратом отмечена положительная динамика регрессии фиброза печени [17].

В настоящее время Лаеннек^® является единственным в мире ГПЧ, пептидный состав которого исследовался методами современной протеомики (многопоточная хроматография с последующим масс-спектрометрическим de novo секвенированием пептидов). Найденные в составе ГПЧ Лаеннек^® пептиды фактора роста гепатоцитов, инсулиноподобного фактора роста 1, пептиды – ингибиторы транскрипционного ядерного фактора каппа В (англ. nuclear factor kappa В, NF-κB), активируемой MAP-киназой протеинкиназы 2 (англ. MAP kinase-activated protein kinase 2, MAPKAPK2), киназы гликогенсинтазы-3-бета (англ. glycogen synthase kinase-3-beta, GSK3β), тирозинкиназы Брутона, каспазы-3 способствуют патогенетической терапии метаболического синдрома посредством устранения инсулинорезистентности, дислипидемии, хронического воспаления и жировой инфильтрации печени. Выявлены 27 гепатопротекторных пептидов ГПЧ Лаеннек^®, которые поддерживают инозитолфосфат-зависимые сигнальные пути гепатоцитов, активируют таргетные белки (RARA, AMPK), ингибируют другие таргетные белки (Notch1, GSK-3, PAK1, TLR4) и в целом могут проявить противовоспалительные, антифибротические, вазодилаторные, антиатеросклеротические и антидиабетические свойства [17][18]. Исследование патоморфологической структуры различных тканей на моделях интоксикации алкоголем или парацетамолом у крыс показало, что ГПЧ Лаеннек^® оказывает не только гепатопротекторное, но и нефропротекторное действие [17].

В настоящей работе представлены результаты масс-спектрометрического de novo секвенирования пептидов в составе препарата на основе ГПЧ Лаеннек^®.

Цель – выявление потенциальных молекулярных механизмов нефропротекторного действия ГПЧ Лаеннек^® на основании биоинформационного анализа собранных масс-спектрометрических данных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Методы протеомного анализа пептидных препаратов более детально описаны в работе [19]. Анализ пептидного состава ГПЧ Лаеннек^® включал четыре этапа:

1) очистка препарата;

2) хроматографическое разделение пептидов;

3) определение многомерного масс-спектра пептидной фракции;

4) de novo секвенирование выделенных пептидов.

Очистка препарата / Drug purification

Очистка препарата состояла в отделении липидной фракции и обессоливании для получения очищенной пептидной фракции.

Для отделения липидной фракции использовали модифицированный метод Брокерхоффа–Даусона–Хюбшера. Сначала проводили мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов. Методику отрабатывали на смеси 1 мл протеолипосом из 1–20 мг фосфатидилхолина и 0,05–0,20 мг бацитрацина или грамицидина А: 1 мл образца очищенного препарата лиофилизировали, доливали гексан, метанол (1:1 объемной части) и разводили в 2 раза раствором 0,25 М NaOH в метаноле. Затем 45 мин инкубировали при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 мин при температуре 75 °C. Последовательно приливали метанол, гексан и воду (1:4:4 объемным частям), перемешивали и центрифугировали 1 мин при 1000 g. Фракцию с гексаном отделяли, водно-метанольную – нейтрализовали HCl до pH 4–6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 мин при 1000 g, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанола и воды (1:1 объемной части), супернатант сливали, затем в смеси хлороформа и метанола (1:1 объемной части), 0,2% трифторуксусной кислоты супернатанты объединяли, высушивали от хлороформа и обессоливали.

Обессоливание пептидной фракции проводили на мини-колонке при помощи центрифугирования. В мини-колонку размерами 0,75×4,5 см (Raining Instrument, США) наливали 2 мл сефадекса G-10 (Pharmacia, Швеция), декантированного в смеси метанола и воды (85:15 объемным частям), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 мин при 1000 g. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не остался 150 мкл раствора. Тогда 150 мкл образца каплями наносили на гель и центрифугировали как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. После процедуры обессоливания потери белка составляли не более 35%.

Хроматографическое разделение пептидов / Chromatographic separation of peptides

Пептиды в составе выделенной пептидной фракции разделяли с использованием параллельной системы хроматографического разделения пептидов Ultimate 3000 RSLC nano-system (Dionex, США).

Исследуемые образцы пептидной фракции помещали в хроматографическую колонку-ловушку Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, США) (2 см, внутренний диаметр 75 мкм, C₁₈, 3 мкм, 100 A) со скоростью 2 мкл/мин в сочетании с 0,1% раствором муравьиной кислоты в воде. Через 5 мин колонка-ловушка автоматически подсоединялась к колонке для аналитической хроматографии Zorbax 300SB-С18 (Agilent Technologies, США) (15 см, внутренний диаметр 75 мкм, 3,5 мкм).

Элюирование пептидов проводили с применением смеси растворителей А (0,1% раствор муравьиной кислоты в дистилированной воде для высокоэффективной жидкостной хроматографии) и В (0,1% раствор муравьиной кислоты в 80% растворе ацетонитрила в воде). Хроматографическое разделение пептидов выполняли с применением линейного градиента растворителя В (от 5% до 40%) при скорости 300 нл/мин в течение 120 мин с последующими стадией промывки (промывка 10 мин 99% растворителем В) и стадией уравновешивания (промывка 10 мин 5% растворителем В).

Масс-спектрометрия с параллельной идентификацией пептидов / Mass spectrometry with parallel peptide identification

Масс-спектрометрию (МС) осуществляли с помощью масс-спектрометра Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, США). МС-данные включали результаты диссоциации пептидов, вызванной столкновением, – так называемые данные CID (англ. сollision-induced dissociation). Были использованы наноаэрозольный источник ионов Flex с напряжением ионизации 1800 В и температурой капилляра 200 °C. Данные масс-спектра собирали в соответствии с количеством имеющегося в МС-камере пептида-прекурсора. Получали данные о частицах пептидов, возникающих при фрагментации исходных пептидов в МС-камере.

Предварительное сканирование осуществляли при разрешении 70 000, диапазон сканирования 400–1200 m/z, целевые значения Automatic gain control автоматической регулировки усиления 1×10⁶, максимальное время впрыскивания 50 мс. Фрагментацию пептидных частиц в МС-камере проводили для 20 наиболее часто встречающихся ионов при нормированной энергии столкновения 30, динамическом исключении 10 с. Сканирование МС/МС образующихся ионов выполняли с разрешением 17 500, целевые значения составили 10⁵, максимальное время впрыска 100 мс, окно изоляции 2,0. Последовательности пептидов определяли с помощью программного обеспечения Mascot¹, базы данных аминокислотных последовательностей SwissProt и посредством de novo секвенирования.

De novo секвенирование / De novo sequencing

De novo секвенирование пептидов проводили на основании данных CID с использованием программного комплекса DNVSEQP. При проведении процедуры CID исследуемые ионы пептидов ускоряются в электростатическом поле и сталкиваются с нейтральными частицами (аргон). При столкновении кинетическая энергия преобразуется во внутреннюю, что приводит к фрагментации пептидного иона на более мелкие фрагменты. Эти фрагменты анализируются посредством тандемной МС, в результате чего получается CID-масс-спектр молекулярных фрагментов пептида. CID-масс-спектр состоит из «массовой» компоненты (список наблюдаемых масс фрагментов) и «интенсивностной» компоненты (список наблюдаемых интенсивностей фрагментов).

Комплекс программ DNVSEQP для проведения de novo секвенирования пептидов аминокислотных последовательностей по данным CID основан на математической теории топологического, метрического, комбинаторного подходов к анализу больших данных и на теории анализа хемографов [20][21] в применении к задаче идентификации аминокислотных последовательностей по CID-масс-спектрам.

Хемограф – размеченный конечный граф без петель с кликовым числом не более 3. Множество вершин хемографа изоморфно множеству атомов молекулы, множество ребер изоморфно множеству химических связей молекулы, а матрица смежности содержит кратности химических связей. Пусть заданы множество меток Y (в качестве меток используются химические типы атомов C, N, O и т.д.), функция разметки вершин μ: V → Y и определена функция оценки метки w: Y→R. Разновидностью функции оценки метки является функция взвешивания m, вычисляющая атомарную массу для соответствующей метки вершины хемографа.

Пусть X=X(V,E) – хемограф c матрицей смежности M(X)={mij}, соответствующий исследуемому пептиду. Множество Γ = {(V,E) | V ⊂ N,E ⊂ N²}, являющееся множеством всех подграфов бесконечного полного графа G = (N,N²) , будем называть множеством всех возможных графов, ∀X ∈ Γ,N – натуральный ряд. Произвольный структурный фрагмент молекулы соответствует некоторому подграфу соответствующего хемографа X – т.е. графу, содержащему некое подмножество вершин данного графа и подмножество инцидентных этим вершинам ребер. Иначе говоря, множество всех структурных фрагментов молекулы изоморфно множеству всех замкнутых подграфов Π(X) хемографа:

Введем оператор модификации хемографов , где n_x – небольшое натуральное число. В практическом случае n_x редко превышает 2, т.к. вероятности тримолекулярных и, тем более, тетрамолекулярных реакций близки к нулю. Определим множество модификаций хемографов , элементы которого соответствуют посттрансляционным модификациям белков, добавлению/удалению ОН-групп и др. Множество возможных МС-фрагментов определяется как S×Г. Соответственно, произвольному фрагменту молекулы X, наблюдаемому в ходе проведения МС-эксперимента с CID-расщеплением молекул, соответствует определенный элемент множества S×Π(X).

Таким образом, хемографу Х соответствует множество хемографов S×Π(X), описывающих возможные фрагменты молекулы Х. Для каждого из этих фрагментов может быть определен инвариант графа – числовая характеристика или упорядоченный список таких характеристик (кортеж), значение которой одинаково для каждого элемента произвольного класса изоморфных графов. Элементарным будем называть инвариант ι:Γ→R; кортеж-инвариантом – инвариант ι:Γ→Rⁿ, n≥2 . Для каждого элемента a = (v(a), e(a)) множества S×Π(X), определим аддитивный числовой инвариант хемографа Х как:

,

так что множеству S×Π(X) соответствует кортеж-инвариант . Молекулярная масса любого элемента a = (v(a), e(a)) вычисляется как частный случай элементарного инварианта ι(a) при условии, что функция w суть функция взвешивания m.

Кортеж-инвариант ι(Х) соответствует массовому компоненту CID-масс-спектра молекулы X и включает все МС-пики, возможные для X. Экспериментально наблюдаемый массовый компонент CID-масс-спектра молекулы, ι_e(Х) является подмножеством кортежа ι(Х), ι_e(Х) ⊆ ι(Х). Анализ разрешимости/регулярности задачи оценки изоморфизма по кортеж-инвариантам позволяет отобрать наиболее информативные элементы кортежа инвариантов ι(Х). Затем, применяя методы машинного обучения на множествах прецедентов ((ι(Х), ι_e(Х))) и получая функцию , можно вычислить массовый компонент CID-масс-спектра по кортежу ι(Х). Расчет значений функции является ключевым компонентом алгоритма de novo секвенирования, использованного в настоящей работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Протеомные эксперименты (n=15) на образцах ГПЧ Лаеннек^® выявили 95 290 откликов в координатах «молекулярная масса – хроматографическое время удержания», соответствующих последовательностям 293 452 пептидов. При этом 55 434 из 293 452 последовательностей пептидов найдены более чем в одном образце препарата. Биоинформационная аннотация данного массива пептидов в легкой (до 1000 Да) пептидной фракции препарата позволила обнаружить 48 пептидов, которые могут проявлять нефропротекторные свойства (табл. 1). Выявленные пептиды включают фрагменты адреномедуллинов и пептиды – ингибиторы таргетных белков FYN, PCSK5, PDGFR, SHH, TGFB1I1, WNK1/4, APH1A, SGK1, STAT1, PRMT1, CARM1, IRAK4, CAMK1, ROCK1/2 (табл. 2), которые проявляют антифибротические и противовоспалительные свойства в тканях почек.

Нефропротекторные пептиды группы адреномедуллинов / Nephroprotective peptides of adrenomedulline group

Адреномедуллины – гипотензивные и вазодилататорные пептиды, участвующие в физиологическом контроле водно-электролитного гомеостаза и осуществляющие диуретическое, натрийуретическое и нефропротекторное действие [22]. Адреномедуллины увеличивают выработку оксида азота почками и уменьшают повреждение почек в модели односторонней обструкции мочеточника у мышей [23]. Биологические эффекты адреномедуллинов опосредованы [24]:

– G-белок-зависимыми рецепторами пептида CGRP, связанного с геном кальцитонина (CGRPR-1);

– кальцитонин-рецептор-подобным рецептором (CRLR).

Специфичность взаимодействия этих рецепторов с адреномедуллинами определяется белками, модифицирующими активность рецепторов, – так называемыми RAMP-белками (англ. repeat associated mysterious proteins).

В составе препарата Лаеннек^® найдено четыре пептидных фрагмента адреномедуллинов, которые взаимодействуют с перечисленными выше рецепторными белками. Пептид GTCT соответствует фрагменту 113-116 GTCT адреномедуллина, который взаимодействует c кальцитониновым рецептором CGRPR-1 (рис. 1а). Пептиды CAVQNL (соответствует фрагменту 115-120 CQVQNL адреномедуллина-2), VQNLTH (117-122 VQNLSH белка адреномедуллина-2), DASSPH (140-145 DPSSPH адреномедуллина-2) взаимодействуют с комплексом рецептора CRLR (рис. 1b). Пептид DASSPH соответствует фрагменту 140-145 DPSSPH адреномедуллина-2, который взаимодействует с рецепторным комплексом CRLR:RAMP1 (рис. 1с). Таким образом, имеющиеся структуры белков – рецепторов адреномедуллинов указывают на биологическую нефропротекторную активность соответствующих пептидов препарата Лаеннек^®.

Пептиды с антифибротическим действием на ткани почек / Peptides with antifibrotic effect on kidney tissue

Рецептор тромбоцитарного фактора роста-бета (PDGFR) необходим для регуляции деления, выживаемости, дифференцировки, хемотаксиса клеток и формирования разветвленной сети капилляров в клубочках почек. Передача сигналов от PDGF-рецептора усиливается при гломерулярном нефрите и Ig²A-нефропатии, что стимулирует развитие фиброза почек [25]. Апробируемые в настоящее время антагонисты PDGFR проявляют низкую специфичность, а их долгосрочные эффекты практически не изучены. Пептид препарата Лаеннек^® QGAY соответствует фрагменту 436-439 QGAY белка SH2B1, где остаток тирозин-439 фосфорилируется PDGFR. Данный остаток является концевым в пептиде QGAY, который, таким образом, не содержит правую половину сайта фосфорилирования и поэтому может ингибировать обсуждаемый таргетный белок (PDGFR) посредством специфичного связывания. Пептид YLSSHR соответствует фрагменту 146-151 YLSSER белка EZR, где остаток тирозин-146 фосфорилируется белком PDGFR. Аналогично пептид YGGLPD соответствует фрагменту 439-444 YGGLSD белка SH2B1, где остаток тирозин-439 также фосфорилируется белком PDGFR [26] (рис. 2).

TGF-бета-рецептор TGFB1I1 – рецептор трансформирующих факторов роста (англ. transforming growth factor) TGFВ, TGFB1, TGFB2 и TGFB3, который регулирует деление и дифференцировку мезенхимальных клеток, заживление ран, продукцию внеклеточного матрикса, иммуносупрессию и фиброзные изменения в тканях [27]. Ингибирование передачи сигналов от рецептора TGFВ снижает интерстициальный фиброз почек в модели гипертонической нефропатии у мышей [28]. Ингибитор рецептора TGF предотвращал гломерулярный склероз в модели нефрита у крыс (линия Thy1) [29]. Пептид препарата Лаеннек^® FHMDHF соответствует фрагменту 424-429 FHPDHF белка TGFB1I1, где замена остатка гистидин-428 приводит к потере активации белка [30], так что данный пептид может ингибировать активность рецептора TGFB1I1. Пептид CGHL, соответствующий фрагменту 366-369 CGHL белка CBLC, также может предотвращать активацию рецептора TGFB1I1 [31].

Найдено четыре пептида препарата Лаеннек^®, которые могут ингибировать профибротический рецептор TGFBR2. Пептид FLAAEE соответствует фрагменту 307-312 FLTAEE белка TGFBR2, где замена близлежащего аминокислотного остатка лейцин-308 тормозит сигналы от рецептора TGFBR2 [32]. Пептид GLPLLV соответствует фрагменту 192-197 GLPLLV белка TGFBR1, где аминокислота серин-191 фосфорилируется белком TGFBR2 [33]. Данная аминокислота не входит в пептид GLPLLV (который, таким образом, может ингибировать рецептор TGFBR2). Пептид FSDLEH соответствует фрагменту 538-543 FSELEH белка TGFBR2, где замена близлежащего аминокислотного остатка аргинин-537 тормозит сигналы от рецептора TGFBR2 [32]. Пептид GPGLPL соответствует фрагменту 190-195 GSGLPL белка TGFBR1, где близлежащие серин-189 и серин-191 не входят в состав пептида GPGLPL. Эти остатки серина фосфорилируются белком TGFBR2 [33], и, таким образом, пептид GPGLPL может ингибировать таргетный белок TGFBR2 (рис. 3).

Белок SHH («сверхзвуковой ежик», англ. sonic hedgehog) является белком-морфогеном, необходимым для формирования органов во время морфогенеза. Избыточная активность передачи сигналов по сигнальному каскаду sonic hedgehog способствует почечному фиброзу [34]. Пептид препарата Лаеннек^® MVDGLSDF соответствует фрагменту 382-388 MDGLSDF белка HHIP, где аминокислоты Мет-382 и Глу-383 принципиально важны для взаимодействия с SHH [35]. Данный пептид, специфически связываясь с белком SHH, может являться пептидом – миметиком белка HHIP, который в соответствии со структурой комплекса «HHIP + SHH» ингибирует белок SHH [35]. Пептид DGLSDF соответствует фрагменту 383-388 DGLSDF белка HHIP, который взаимодействует с белком SHH. Пептид HLLFVA соответствует фрагменту 270-275 HLLFVA белка SHH, где остаток гистидин-270 принципиально важен для аутоактивации SHH [36]. Поэтому пептид HLLFVA также является потенциальным ингибитором белка SHH.

Серин/треонин-протеинкиназа WNK1 участвует в регуляции электролитного гомеостаза, внутриклеточной передаче сигналов и выживании клеток, модулирует активность натрий-калиевых котранспортеров хлоридов и активирует киназу SGK1, вызывающую воспаление и фиброз тканей. Серин/треонин-протеинкиназа WNK4 также необходима для регуляции электролитного гомеостаза и активации кииназы SGK1. Последняя вызывает почечный фиброз и ингибирует куллин-3, который является компонентом комплекса BTB-CUL3-RBX1 убиквитин-протеинлигазы Е3. Комплекс BTB-CUL3-RBX1 опосредует убиквитинирование и последующую протеасомную деградацию сигнальных белков [37]. Нарушение куллин-3-опосредованного убиквитинирования вызывает повреждение проксимальных канальцев и фиброз почек. Куллин-3 регулирует гомеостаз электролитов посредством убиквитинирования и деградации WNK4 [38]. WNK4 ингибирует Ca(2+)-активируемые калиевые каналы «большой проводимости» (BK-каналы) посредством сигнального пути митоген-активируемых протеинкиназ [39].

Пептиды препарата Лаеннек^® NVGVCA и SVTDGV могут ингибировать обе WNK-киназы. Пептид NVGVCA соответствует фрагменту 529-534 NAGVCA белка KLHL3, где близлежащий аргинин-528 нарушает взаимодействие с WNK1 [40]. Это специфическое взаимодействие пептида с WNK1 позволяет говорить о блокаде эффектов WNK1 пептидом NVGVCA. Пептид SVTDGV соответствует фрагменту 342-347 SVTDAV белка NEDD4L, где остаток серин-342 фосфорилируется WNK1/4 [41], так что пептид SVTDGV может ингибировать эти две WNK-киназы (рис. 4).

Аргинин-N-метилтрансфераза PRMT1 метилирует гуанидиновую группу аргинина в белках [42], опосредуя эпигенетические эффекты, осуществляемые гистонами – белками упаковки ДНК. Фермент PRMT1 активирует экспрессию генов и опосредует активацию почечных фибробластов и фиброгенез посредством передачи сигналов через белки STAT/SMAD [43]. Пептид препарата Лаеннек^® PLLVNQP соответствует фрагменту 97-103 PLLINQP белка B3GNT9, в котором слева от данного пептида расположен аргинин-96, модифицируемый ферментом PRMT1 [44]. Соответствующий аргинин отсутствует в аминокислотной последовательности пептида PLLVNQP, поэтому данный пептид может ингибировать фермент PRMT1. Пептид GDGGVY соответствует фрагменту 272-277 GDGGIY белка DVL3, где аргинин-271 слева (не входит в аминокислотную последовательность GDGGVY) модифицируется ферментом PRMT1 [45]. Пептид GTWL соответствует фрагменту 205-208 GTWL белка DCAF8. Известно, что в белке DCAF8 аргинин-204, расположенный слева от фрагмента 205-208 GTWL, модифицируется ферментом PRMT1 [46], поэтому GTWL – потенциальный ингибитор фермента PRMT1.

Rho-ассоциированные протеинкиназы ROCK1/2 – регулятор клеточной адгезии. Ингибирование белков ROCK1/2 тормозит развитие почечного фиброза и метаболических нарушений в эпителиальных клетках проксимальных канальцев, также улучшая функцию почек при острой ишемии почек у крыс [47]. Четыре пептида препарата Лаеннек^® могут ингибировать киназы ROCK1/2. Пептид EPPN соответствует фрагменту 505-508 EPPT белка LINGO4, где треонин-508 фосфорилируется посредством ROCK1 [48]. Пептид ELCS соответствует фрагменту 138-141 SLCS белка PRND, где серин-138 фосфорилируется ROCK1 [49]. Пептид SSPNQG соответствует фрагменту 364-369 SSPTQG белка MAPK8IP3, где серин-364 фосфорилируется посредством ROCK1 [50]. Пептид DTTGSD соответствует фрагменту 381-386 DTTDSD белка PTEN, где серин-380 (не представлен в пептиде DTTGSD) фосфорилируется ROCK1 [51], треонин-382 фосфорилируется ROCK1 (рис. 5).

Пептиды, снижающие метаболический стресс нефроцитов / Peptides that reduce the metabolic stress of nephrocytes

Пробелок конвертаза PCSK5 участвует в протеолизе пробелков с аминокислотным мотивом RXXX[K/R]R [52]. Исследование пептидома мочи в сочетании с транскриптомным анализом позволило определить конвертазу PCSK5 как таргетный белок, избыточная активность которого ассоциирована с наличием у пациентов хронической почечной недостаточности [53].

Пептид препарата Лаеннек^® HASGTF соответствует фрагменту 98-103 HAEGTF белка GCG, слева от которого расположен сайт 97-98, подвергающийся протеолизу посредством конвертаз PCSK1/5. Очевидно, что пептид 98-103 HAEGTF не содержит остаток, соответствующий остатку 97 белка GCG, что указывает на ингибиторные свойства пептида HASGTF по отношению к конвертазам PCSK1/5. Пептид HAAGSF соответствует фрагменту 146-151 HADGSF белка GCG, где расположенный слева сайт 145-146 подвергается протеолизу посредством конвертаз PCSK1/5. Поэтому пептид HADGSF – ингибитор конвертаз PCSK1/5. Пептид FPEEV соответствует фрагменту 132-136 FPEEV белка GCG, где расположенный рядом сайт 130-131 подвергается протеолизу посредством конвертаз PCSK1/5, так что пептид FPEEV – также ингибитор PCSK1/5.

Тирозин-протеинкиназа Fyn участвует в регуляции роста и выживания клеток, интегрин-опосредованной передаче сигналов, ремоделировании цитоскелета, формировании иммунного ответа. После активации посредством киназы PKA киназа Fyn связывается с белковым комплексом PTK2/FAK1, обеспечивая фосфорилирование и активацию комплекса PTK2/FAK1 [54]. Ингибиторы FYN ослабляют диабетическое повреждение почек, блокируя стресс эндоплазматического ретикулума (который связан с накоплением неправильно свернутых белков) [55]. Пептид препарата Лаеннек^® LYST соответствует фрагменту 59-62 LYST белка TGFB1I1 (где остаток тирозин-60 фосфорилируется киназой FYN [56]) и может являться частичным антагонистом FYN. Пептид DHLYRT соответствует фрагменту 57-62 DHLYST белка TGFB1I1, где в пептиде DHLYRT вместо серина-61 присутствует аргинин, что будет ингибировать киназу FYN. Таким образом, пептиды LYST и DHLYRT, ингибируя киназу FYN, могут снижать диабетическое повреждение почек.

Гамма-секретаза APH-1A катализирует внутримембранное расщепление интегральных мембранных белков, таких как рецепторы Notch [57], тем самым регулируя сигнальные каскады Notch и Wnt. Notch представляет собой мембранный белок, активируемый встроенным в мембрану протеолитическим комплексом секретазы. Путь Notch является потенциальной терапевтической мишенью для лечения почечных заболеваний. Нефрозащитные эффекты ингибиторов секретазы были исследованы на модели острого повреждения тканей почек у мышей, вызванного введением нефротоксичного фитоэкстракта цветковых растений Aristolochiacea [58].

Три пептида препарата Лаеннек^® могут ингибировать гамма-секретазу. Пептид LLLLF соответствует фрагменту 726-730 LLLLF белка CDH1, где расположенный справа сайт 731-732 (не входит в пептид LLLLF) протеолизируется гамма-секретазой. Пептид LLLLVF соответствует фрагменту 725-730 LLLLLF белка CDH1, где расположенный справа сайт 731-732 протеолизируется гамма-секретазой. Пептид MVDGVV соответствует фрагменту 706-711 MVGGVV белка APP, где расположенный справа и не входящий в пептид MVDGVV сайт 711-712 подвергается протеолизу гамма-секретазой. Таким образом, все три пептида – потенциальные ингибиторы APH-1A, снижение активности которой может способствовать облегчению течения острого повреждения почек нефротоксикантами.

Нефропротекторные пептиды с противовоспалительным действием / Nephroprotective peptides with anti-inflammatory effect

Серин/треонин-протеинкиназа Sgk1 вовлечена в регуляцию ионных каналов, мембранных транспортеров, клеточных ферментов, факторов транскрипции, влияет на рост, выживание, миграцию и апоптоз клеток. SGK1 способствует регуляции задержки Na⁺ в почках, элиминации K⁺ почками, инсулинозависимой солевой чувствительности артериального давления, проявляет профибротические эффекты. SGK1 активирует Na⁺-каналы ENAC, SCN5A и ASIC1, K⁺-каналы KCNJ1/ROMK1 и провоспалительный фактор NF-κB. Высокая активность SGK1 способствует развитию артериальной гипертонии и диабетической нефропатии [59]. SGK1 индуцирует кальцификацию гладкомышечных клеток сосудов посредством передачи сигналов NF-κB [60]. Повышенная активность SGK1 усиливает повреждение почек, индуцированное минералокортикоидами, хлоридом натрия [61], и TH17-зависимое повреждение почек [62]. SGK1 ингибирует деградацию TGF-бета-зависимыми факторами транскрипции Smad2/3, приводя к воспалению и фиброзу тканей почек [63]. Ингибирование SGK1 подавляет эпителиально-мезенхимальный переход и способствует аутофагии эпителиальных клеток почечных канальцев при диабетической нефропатии, указывая на то, что SGK1 – важный таргетный белок в фармакотерапии заболеваний почек [64].

В настоящем исследовании найдено четыре нефропротекторных пептида препарата Лаеннек^®. Пептид LGTGGF соответствует фрагменту 21-26 LGTGGF белка CHUK, где аминокислота треонин-23 фосфорилируется SGK1 [65]. Пептид FLAVGGDV соответствует фрагменту 611-618 FLAVGRDV белка APBB1, где расположенный слева серин-610 (не входящий в пептид FLAVGGDV) фосфорилируется SGK1. Пептид GAGGFG соответствует фрагменту 22-27 GTGGFG белка CHUK, где треонин-23, который фосфорилируется SGK1 [66], отсутствует в пептиде GAGGFG, так что последний будет блокировать активный сайт киназы SGK1. Пептид LGAGGF соответствует фрагменту 21-26 LGTGGF белка CHUK, так что вместо треонина-23 (который фосфорилируется SGK1 [66]) в пептиде LGAGGF представлен остаток аланина. Поэтому пептид LGAGGF будет ингибировать SGK1 (рис. 6), снижая воспаление и фиброз в тканях почек, способствуя нормализации артериального давления и нефропротекции при сахарном диабете.

Преобразователь сигнала и активатор транскрипции STAT1 опосредует клеточные ответы на цитокины и факторы роста через протеинкиназы, которые приводят к активации киназ TYK2/JAK1. Фосфорилированный STAT1/2 димеризуется и связывается с другими белками с образованием активного комплекса транскрипционного фактора [ 28753426]. Флувастатин ингибирует активацию белков JAK и STAT1/2 в почечных клубочках и мезангиальных клетках у крыс со стрептозотоциновой моделью диабета. Ингибирование фосфорилирования JAK/STAT флувастатином проявляет нефропротекторный эффект при диабетической нефропатии [67].

Пептид препарата Лаеннек^® TGYLKT соответствует фрагменту 699-704 TGYIKT белка STAT1, где остаток тирозин-701 фосфорилируется JAK1/2 киназами [68]. Пептид YLYL соответствует фрагменту 454-457 YLYL белка EPOR, где аминокислота тирозин-456 необходима для взаимодействия с STAT1/3 и его активации, тирозин-454 и тирозин-456 фосфорилируются JAK2 [69]. Поэтому пептид YLYL может одновременно ингибировать активацию STAT1/3 и киназу JAK2, тем самым способствуя нефропротекции.

Гистон-аргининметилтрансфераза CARM1 метилирует остатки аргинина в белках, участвующих в упаковке ДНК, регуляции транскрипции, сплайсинге и стабильности мРНК. При воспалительной стимуляции моноцитов белок CARM1 действует как активатор NF-κB-зависимых провоспалительных цитокинов IP10 и MCP1 в клетках почек [70]. Пептид препарата Лаеннек^® RRME соответствует фрагменту 603-606 RRME белка EP300, где аргинин-604 взаимодействует с CARM1 [71]. Пептид TPTPAG соответствует фрагменту 243-248 TPTPAG белка QKI, где аргинин-242 слева взаимодействует с CARM1, также как и в пептиде TPTPSGP [46] (рис. 7). Оба эти пептида будут ингибировать белок CARM1, снижая активацию провоспалительного фактора NF-κB.

Киназа IRAK4, ассоциированная с рецептором ИЛ-1, участвует в провоспалительных сигнальных путях толл-подобных рецепторов и ИЛ-1R [72]. IRAK4 фосфорилирует белок IRAK1, тем самым стимулируя его убиквитинирование (которое, в свою очередь, приводит к деградации этого белка на протеасомах клетки). Затем убиквитин-связывающий домен киназы IKBKG объединяет комплексы IRAK1-MAP3K7 и TAK1-TRAF6, тем самым активируя киназы IKKA и IKKB, транслокацию и активацию фактора NF-κB [73]. Нефропротекторные эффекты ингибитора IRAK4 осуществляются посредством их противовоспалительного действия [74]. Пептид препарата Лаеннек^® DDVLLGL соответствует фрагменту 99-105 DDVLLEL белка MYD88, где расположенный слева аргинин-98 взаимодействует с IRAK4, а также с фактором NF-κB [75]. Пептид LSLFL соответствует фрагменту 33-37 LSLFL белка MYD88, где серин-34 взаимодействует с NF-κB и IRAK4 [75]. Поэтому пептиды DDVLLGL и LSLFL могут тормозить воспаление и осуществлять нефропротекцию одновременно по двум механизмам: ингибирование IRAK1 и ингибирование NF-κB.

Таким образом, исследованный ГПЧ содержит нефропротекторные пептиды – фрагменты адреномедуллинов, пептидов-ингибиторов киназ (FYN, WNK1/4, SGK1 и др.) и фибротических рецепторов PDGFR, TGFB1I1 (рис. 8). Действуя через описанные молекулярные механизмы, эти пептиды ГПЧ Лаеннек^® могут реализовывать нефропротекторные эффекты посредством снижения воспаления, фиброза, стрессовых состояний клеток тканей почек, способствуя коррекции нефрогепатометаболических нарушений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Нефрогепатометаболические нарушения, связанные с одновременной дисфункцией печени и почек, существенно усложняют задачи гепатопротекторной фармакотерапии. Во-первых, сочетанная патология важнейших органов детоксикации требует использования препаратов с высоким уровнем безопасности, в т.ч. с минимальной нагрузкой на выводящие системы организма. Во-вторых, учитывая высокий уровень воспаления и фибротических трансформаций при совместном поражении печени и почек, фармакотерапия должна быть дополнена противовоспалительными и антифибротическими препаратами. В-третьих, в связи с множественностью молекулярных механизмов формирования воспаления и фиброза необходимо, чтобы данные препараты воздействовали на разные таргетные белки. В-четвертых, при инфекционном генезе поражений печени и почек следует включать в фармакотерапию препараты с противовирусными (антибактериальными) свойствами.

Очевидно, что буквалистское применение указанных принципов приведет к выраженной полипрагмазии. В то же время стандартизированные ГПЧ характеризуются описанными выше свойствами. В частности, в настоящей работе описаны 48 пептидов ГПЧ Лаеннек^®, которые могут проявлять нефропротекторные и антифибротические эффекты (пептиды с гепатопротекторным, противовоспалительным, противовирусным действием были описаны нами ранее).