In silico моделирование эффектов взаимодействия молекулы-кандидата SV-1010 с опиоидными рецепторами

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) ингибируют циклооксигеназу-2, что снижает синтез провоспалительных простагландинов. Применение НПВП для лечения состояний, сопровождающихся воспалением и болью, – важная альтернатива опиоидным анальгетикам, применение которых существенно ограничено развитием зависимости. Различия между известными НПВП включают [1]:

– центральные механизмы анальгетического действия (напрямую не связанные с модуляцией уровней и активности простагландинов), в частности через рецепторы нейротрансмиттеров);

– мультитаргетное фармакологическое действие (модуляция активности не только ферментов простагландинового метаболизма и нейрорецепторов, но и других таргетных белков протеома человека).

Проведенное ранее хемопротеомное моделирование перспективной молекулы-кандидата SV-1010 в сравнении с известными НПВП (диклофенак, нимесулид, кеторолак) на протеоме крыс показало, что соединение SV-1010 в меньшей степени, чем остальные молекулы, может ингибировать дофаминовые рецепторы типов D1 и D2 и в большей степени – транспортер гамма-аминомасляной кислоты (65 нМ) и рецепторы 1/2b N-метил-D-аспартата (175 нМ). Кроме того, хемопротеомное моделирование продемонстрировало, что SV-1010 может активировать каннабиоидные рецепторы CB2, опиоидные рецепторы, ингибировать ферменты биосинтеза лейкотриенов и CC-рецепторы провоспалительных хемокинов [2].

Потенциальный эффект молекулы-кандидата SV-1010 на опиоидные рецепторы, в частности каппа-опиоидные (КОР), представляет собой важный аспект центрального действия этого перспективного НПВП. Связывая опиоидный пептид динорфин в качестве основного эндогенного лиганда, КОР участвуют в модуляции ноцицепции, двигательного контроля и настроения [3].

Кроме динорфина КОР связывают различные природные алкалоиды, терпены и синтетические лиганды. Примерами агонистов КОР, используемых в медицине в качестве анальгетиков, являются буторфанол, налбуфин, леворфанол и др. В экспериментальной фармакологии в качестве агнистов КОР используются соединения U-50488, FE-202845, CR665. Изучается терапевтический потенциал агонистов КОР в лечении наркозависимости [4][5]. Антагонисты КОР находятся на стадии клинической разработки для лечения большого депрессивного расстройства, а также наркозависимости [6]. И агонисты, и антагонисты КОР вызывают побочные эффекты (дисфории, галлюцинации, диссоциации, зависимость), что ограничивает их клиническое применение [7].

На основе исследований связывания рецепторов in vitro были охарактеризованы три варианта каппа-рецептора, обычно обозначаемые как κ1, κ2 и κ3 [8]. Однако в реальности идентифицирован единственный ген каппа-рецептора – OPRK1, расположенный на 8‑й хромосоме (цитогенетическая полоса 8q11.23) [9]. Поэтому указанные выше подтипы каппа-рецепторов, наиболее вероятно, возникают в результате модуляции сродства молекул-лигандов к КОР посредством дополнительных взаимодействий с другими белками [10]. Ген OPRK1 экспрессируется в головном мозге, спинном мозге и периферических тканях, включая иммунные клетки и эндотелий [11][12].

Цель – изучить взаимодействия молекулы-кандидата НПВП (SV-1010) с опиоидными рецепторами и сравнить с эффектами известных молекул-агонистов (буторфанола и U-50488) методами хемореактомного анализа и докинга.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Проведен анализ взаимодействий молекулы SV-1010 с опиоидными рецепторами. Анализ выполняли in silico посредством хемореактомного моделирования и процедуры так называемого докинга – моделирования взаимодействий молекул с конкретной структурой таргетного белка.

Молекулы сравнения / Comparison molecules

Оценку эффектов взаимодействий SV-1010 с опиоидными рецепторами различных типов осуществляли в сравнении с буторфанолом (синтетический агонист опиоидных рецепторов морфинового типа, агонист КОР) и соединением U-50488 (агонист КОР, использующийся в экспериментальной фармакологии и не проявляющий антагонизма к мю-опиоидным рецепторам).

Хемореактомный анализ / Chemoreactomic analysis

Хемореактомный анализ осуществлен посредством конгломерата методов хемоинформационного анализа молекул, развиваемых в научной школе академиков РАН Ю.И. Журавлёва и К.В. Рудакова [3–5].

В рамках постгеномной парадигмы молекула любого лекарственного средства «мимикрирует» под определенные метаболиты и, связываясь с теми или иными белками протеома, производит соответствующие данному лекарству эффекты [13]. Процедура анализа основана на новейших технологиях машинного обучения, разрабатываемых в теории топологического и метрического анализа признаковых описаний [14–16].

Хемореактомный анализ механизмов действия НПВП проводили в три этапа. На первом этапе формировали выборку исходных данных (поиск по ключевым словам “opioid”, “opiate” в базе данных PubChem, затем извлечение выборок данных о фармакологических активностях). Всего было найдено 38 опиат-связанных активностей для 227 молекул. На втором этапе устанавливали список молекул с известными свойствами, наиболее близкими к каждому из исследуемых соединений посредством вычисления метрического химического расстояния d_χ между молекулами. Процедуры вычисления d_χ основаны на комбинаторной теории разрешимости [14]. На третьем этапе для каждой молекулы из баз данных извлекали всю имеющуюся информацию об экспериментальном измерении ее различных биологических свойств и выполняли оценку биологических активностей с вычислением соответствующих констант (констант связывания, констант ингибирования и др.) [17].

Как и в работах [1][2], для количественной оценки эффектов НПВП проводили вычисление константы связывания (Kd) и константы полумаксимальной эффективной концентрации (англ. half-maximal effective concentration, EC50) соответствующих рецепторов.

Докинг каппа-опиоидных рецепторов / Docking of kappa opioid receptors

Построение 10 конформаций каждого из изученных соединений выполнено в программе MarvinSketch 17.1.23¹ (Chemaxo, США). Эти конформации оптимизированы в программе MOPAC2012² (MOPAC, США), и для каждого соединения отобрана конформация с минимальной энергией молекулы.

Докинг в рентгеноструктурную модель димера КОР человека (PDB-код 4DJH) [18] проводили с помощью программы AutoDock Vina 1.1.1 (Dr. Oleg Trott, Molecular Graphics Lab of Scripps Institute, США) [19]. В процессе докинга каждое соединение по 5 раз «докировалось» в каждый из двух сайтов димера с вычислением минимальной энергии докинга ΔE. Детальное описание процедуры ансамблевого докинга представлено в работе [20].

Расчет по энергии докинга ΔE констант связывания Kd проводили по формуле:

Kd = e–Δ^E/RT,

где R – газовая постоянная, равная 8,314 Дж/(моль·K); T – температура (стандартное значение в докинге равно 300 °K).

Анализ механизма связывания соединения SV-1010 с сайтом КОР выполнен с помощью программы LigandScout 4.2.1³ (Inte:Ligand GmbH, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Результаты проведенного in silico моделирования включили:

– хемореактомный анализ/моделирование значений констант Kd для взаимодействий с опиоидными рецепторами человека при различных условиях эксперимента;

– докинг изученных молекул в структуру каппа-рецептора человека с получением значений энергий связывания и констант Kd;

– сопоставление результатов хемореактомного и докингового моделирования Kd;

– хемореактомное моделирование значений ЕС50 опиоидных рецепторов.

Хемореактомный анализ значений Kd для взаимодействий с опиоидными рецепторами человека / Chemoreactomic analysis of Kd values for interactions with human opioid receptors

Результаты хемореактомного анализа взаимодействий исследованных молекул с опиоидными рецепторами, суммированые в таблицах 1–3 и на рисунке 1, позволяют сделать несколько важных выводов.

Во-первых, медианные и средние значения констант Kd соединения SV-1010 сопоставимы с оценками значений констант, полученных для известных агонистов опиоидных рецепторов. В частности, средние значения Kd лежали в диапазоне 75–98 нМ для дельта-рецепторов, 62–81 нМ для каппа-рецепторов, 198–244 нМ для мю-рецепторов (табл. 4). Таким образом, хемореактомное моделирование указывает на степень сродства соединения SV-1010 к опиоидным рецепторам, сопоставимую со сродством буторфана и U-50488.

Во-вторых, для вещества SV-1010 среди изученных подтипов опиоидных рецепторов наименьшие средние значения Kd установлены именно для каппа-рецепторов (64,8±46,3 нМ; дельта- и мю-рецепторы: 79,9±77,6 и 243,8±246,9 нМ соответственно) (см. табл. 4). Этот результат указывает на перспективность дальнейших экспериментальных и других исследований соединения SV-1010 с акцентом именно на КОР.

В-третьих, более детальный анализ результатов индивидуальных хемореактомных экспериментов по каппа-рецепторам (см. табл. 2) указал на отсутствие существенной разницы в связывании молекул соединения SV-1010 опиоидными рецепторами типов каппа-1 и каппа-2. В самом деле, для 6 из 16 использованных выборок данных (и соответствующих хемореактомных экспериментов) были известны конкретные подтипы КОР. В результате хемореактомного моделирования получены значения 24,9 нМ, 48,9 нМ, 51,9 нМ для связывания с каппа-1-опиоидным рецептором и значения 23,7 нМ, 33,5 нМ, 54,5 нМ для связывания с каппа-2-опиоидным рецептором. Очевидно практически полное совпадение с интервалом полученных оценок Kd для каппа-1- и каппа-2-рецепторов (24,9–51,9 и 23,7-54,5 нМ соответственно).

Докинг молекул в структуру каппа-рецептора человека / Docking of molecules into human kappa receptor structure

Выполнен докинг молекулы-кандидата SV-1010, а также агонистов буторфанола и U-50488 в специфический сайт связывания КОР. Получены оценки энергий связывания, и на основе последних рассчитаны значения Kd (табл. 5). В соответствии с расчетными значениями Kd аффинность в отношении КОР у соединения SV-1010 в 78,6 раза выше, чем у парциального каппа-агониста буторфанола, и в 6,3 раза выше, чем у селективного каппа-агониста U-50488.

Согласно полученным результатам докинга ключевыми аминокислотами сайта КОР, связывающими соединение SV-1010, являются ILE730, VAL667, MET579, ILE726, TRP723, ILE460 и TYR464 (рис. 2а). Таким образом, связывание молекулы-кандидата каппа-рецептором обусловлено тремя гидрофобными взаимодействиями бензольных фрагментов структуры SV-1010 с вышеперечисленными аминокислотами сайта КОР (рис. 2b).

Сопоставление результатов хемореактомного моделирования и докинга / Comparing results of chemoreactomic modeling and docking

Отдельным вопросом является сопоставление результатов докинга с результатами хемореактомного моделирования взаимодействий каппа-рецепторов с изученными молекулами. При совпадении порядка полученных величин средних значений Kd для SV-1010 и U-50488 (SV-1010: Kd 64,8±46,3 нМ, докинг 31,0 нМ; U-50488: Kd 80,8±82,9 нМ, докинг 197 нМ) очевидно существенное отличие значений для буторфанола – на два порядка (Kd 62,4±59,9 нМ, докинг 2437,0 нМ).

Такие отличия вполне ожидаемы, принимая во внимание следующие факторы:

– докинг-моделирование проводится для отдельной молекулы белка вне какого-либо клеточного контекста;

– хемореактомное моделирование проводится в весьма широком диапазоне условий.

В самом деле, результаты хемореактомного моделирования взаимодействий молекул с каппа-рецепторами получены посредством вытеснения различных радиолигандов ([ 3H]U69593, [ 3H]дипренорфин), различных типов рецепторов (каппа-1, каппа-2), в различных клетках (гомогенат клеточных мемран, клетки линий CHO, HEK293), в различных буферных растворах (диметилсульфоксид, Trizma-основание), при различных количествах изучаемых веществ и т.д. Поэтому выбор условий, оптимальных для наиболее адекватного сопоставления результатов хемореактомного анализа и докинга, представляет собой нетривиальную исследовательскую задачу.

В настоящей работе мы просто провели корреляционный анализ между значениями Kd, полученными методом докинга, со значениями Kd, полученными в ходе хемореактомного анализа при различных условиях, перечисленных в таблице 2. В результате были отобраны наборы условий, соответствующие максимальным значениям коэффициента корреляции, которые суммированы в таблице 6.

Таким образом, корреляционный анализ продемонстрировал, что наилучшим соответствием результатам докинга отличался хемореактомный эксперимент, проведенный на основании данных по связыванию КОР in vitro с замещением радиолиганда [ 3H]U69593, в клетках HEK293 в соответствующем буфере (5% диметилсульфоксид, 50 мМ Trizma-основания, pH 7,4) с использованием 96-луночных планшетов. Оценка «х» значения Kd, полученная в результате проведения этого эксперимента, может быть пересчитана в докинговую оценку по формуле «35,8x – 4790» (с коэффициентом корреляции, близким к единице) (рис. 3).

Хемореактомное моделирование значений констант ЕС50 опиоидных рецепторов / Chemoreactomic modeling of EC50 constant values for opioid receptors

Выше представлены оценки значений констант сродства Kd к опиоидным рецепторам. Однако само по себе сродство к рецепторам не означает активации рецепторов. Для анализа воздействия на активность рецептора необходимо получить оценки агонистических свойств изучаемых молекул по отношению к рецепторам. Поэтому проведен хемореактомный анализ констант ЕС50 опиоидных рецепторов, результаты которого представлены в таблицах 7, 8.

Результаты хемореактомного моделирования констант ЕС50 подтверждают данные анализа констант связывания Kd. Хемореактомные оценки значений Kd для взаимодействий SV-1010 с каппа-рецепторами лежат в диапазоне десятков наномоль на литр (64,8±46,3 нМ) (см. табл. 4). Аналогично, значения ЕС50 составляют десятки наномоль на литр (94,6±84,8 нМ) (см. табл. 8).

Соединение SV-1010 характеризуется большим сродством к каппа-рецепторам, чем к мю-рецепторам (Kd 243,8±246,9 нМ), и значения полученных оценок константы ЕС50 для мю-рецепторов также выше (162,0±97,2 нМ). Заметим, что хемореактомная оценка ЕС50 для буторфанола по отношению к КОР (43,1±59,4 нМ) сопоставима с экспериментальной оценкой частичной агонистической активности буторфанола в отношении КОР (EC50 57 нМ) [21]. Таким образом, хемореактомное моделирование ЕС50 подтверждает гипотезу о том, что соединение SV-1010 может являться агонистом КОР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

НПВП осуществляют свое фармакологическое действие не только через ингибирование циклооксигеназы-2, но и посредством других молекулярных механизмов. В настоящей работе изучены взаимодействия молекулы-кандидата SV-1010 с опиоидными рецепторами в сравнении с известными агонистами опиоидных рецепторов (буторфанол, U-50488). Оценка проведена с помощью двух взаимодополняющих методов молекулярной фармакологии in silico: посредством хемореактомного анализа и докинга.

Среди изученных подтипов опиоидных рецепторов для вещества SV-1010 установлены наименьшие значения Kd для КОР (64,8±46,3 нМ; дельта- и мю-рецепторы: 79,9±77,6 и 243,8±246,9 нМ соответственно). Не обнаружено существенной разницы в связывании молекул соединения SV-1010 опиоидными рецепторами типов каппа-1 и каппа-2. Докинг позволил получить значения Kd и сформулировать механизм связывания соединения SV-1010 с сайтом КОР. Результаты хемореактомного моделирования констант ЕС50 отчасти подтвердили данные анализа констант связывания Kd (прежде всего то, что SV-1010 может характеризоваться большим сродством к КОР, чем к мю-рецепторам).

Таким образом, вследствие потенциально значительного взаимодействия с КОР молекула-кандидат SV-1010 может являться НПВП с выраженными противоболевым и нормотимическим эффектами.