Лигнан 7-гидроксиматаирезинол в контексте постгеномной фармакологии

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

7-гидроксиматаирезинол (7(ОН)МР), как и некоторые другие лигнаны ели (сезаминол, пинорезинол и др.), проявляет противовоспалительные и другие полезные терапевтические эффекты [1–3]. Важными особенностями 7(ОН)МР являются его низкая хроническая токсичность (полулетальная доза в диапазоне от 600 до 2000 мг/кг/сут) и отсутствие тератогенного и аллергического эффектов [4][5]. Результаты исследований (экспериментальных и клинических) указали на перспективность 7(ОН)МР как противовоспалительного и онкопротективного средства [6]. Однако молекулярные механизмы осуществления этих и других возможных фармакологических эффектов 7(ОН)МР не вполне изучены.

Исследование механизмов молекулярного действия лекарств и молекул-кандидатов – крайне трудоемкий процесс, требующий многолетней напряженной экспериментальной и аналитической работы по конкретному веществу. Постгеномный метод в фармакологии предлагает универсальный подход к характеризации свойств и механизмов молекулярного действия потенциальных лекарств. Важными его компонентами являются изучение эффектов действия лекарств на протеом (совокупность всех белков организма) и транскриптом (совокупность всех РНК организма, образующихся в результате транскрипции генов).

Цель – определение молекулярных механизмов действия 7(ОН)МР – основного лигнана экстрактов ели, обладающего онкопротективными и противовоспалительными свойствами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Хемореактомное моделирование воздействия 7(ОН)МР на протеом выполняли в сравнении с контрольными молекулами (молекулы сравнения – 17-эстрадиол, β-ситостерол, эпигаллокатехин-3-галлат) и путем хемотранскриптомного анализа (оценка воздействия на экспрессию генов) в линии опухолевых клеток.

Хемореактомный анализ / Chemoreactomic analysis

Анализ 7(ОН)МР проведен на основе хемоинформационного подхода (сопоставление химической структуры молекулы-запроса с неизвестными фармакологическими свойствами со структурами молекул в базе данных, для которых свойства были изучены). Хемореактомный анализ основан на новейших технологиях машинного обучения: комбинаторной теории разрешимости и топологической теории распознавания [7–10].

Объектами исследования являются хемографы – особая разновидность графа (математического объекта, совокупности множества вершин и множества ребер) [11]. На основании фундаментальных теоретических результатов (теорема о полноте инварианта и критериях разрешимости/регулярности и комбинаторное тестирование локальной полноты) определяется метрическое расстояние d_χ (Х₁,Х₂) между хемографами Х₁ и Х₂, которое используется для решения задачи поиска молекул, структурно схожих с 7(ОН)МР. На основании списка схожих молекул осуществляется прогноз фармакологической активности.

Хемотранскриптомный анализ / Chemotranscriptomic analysis

Результаты транскриптомных экспериментов в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO)¹ представлены в виде таблицы, в столбцах которой указаны гены, а в строках – соответствующие воздействия на клетку (например, те или иные молекулы). При задании типа клеток (например, фибробласты), концентрации и времени воздействия каждый столбец такой таблицы соответствует химической реакции «Ген_i → мРНК_i», в результате которой осуществляется синтез i-й молекулы мРНК_i, соответствующей i-му гену (Ген_i). Расстояние d_χ является настраиваемой метрикой, т.к. содержит произвольно настраиваемые параметры – веса ω_k. По этим данным настраиваются расстояния d_χ (Х₁,Х₂) между хемографами, на основании которых затем и оцениваются изменения экспрессии каждого i-го гена.

Более детальное описание методологии хемотранскриптомного анализа представлено в работе [12]. Оценка групп генов, вовлеченных в согласованные изменения экспрессии, устанавливались методом функционального связывания [13–15]. Использованы новые математические подходы для определения интервалов информативных значений численных параметров, нахождения метрических сгущений в пространстве параметров биомедицинского исследования [16] и построения метрических карт [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Хемореактомный анализ / Chemoreactomic analysis

Хемореактомный анализ молекулы 7(ОН)МР нами был проведен ранее [11]. Хемореактомные оценки ее свойств сравнили с оценками для 17-эстрадиола, фитоэстрогена, β-ситостерола и эпигаллокатехин-3-галлата, что позволило сформулировать молекулярные механизмы противовоспалительных (ингибирование 5-липоксигеназы, матриксной металлопротеиназы 2 (англ. matrix metalloproteinase 2, ММР2), митоген-активируемой протеинкиназы 14 (англ. mitogen-activated protein kinase 14, МАРК14), рецептора лейкотриена В4, рецептора простагландина), онкопротективных (антиоксидантный эффект за счет ингибирования гемоксигеназы-2, ингибирование циклин-зависимых киназ (англ. cyclin-dependent kinase, CDK) 3 и 4, рецептора фактора роста эпидермиса (англ. epidermal growth factor receptor, EGFR), белка mTOR), вазодилаторных (ингибирование адренорецепторов и ренина), а также антибактериальных и противовирусных свойств молекулы 7(ОН)МР [11]. Рассмотрим противовоспалительные и онкопротективные эффекты.

Противовоспалительные свойства

Результаты хемореактомного моделирования подтвердили противовоспалительные эффекты 7(ОН)МР, обусловленные ингибированием окисления арахидоновой кислоты 5-липоксигеназой, ММР2 и МАРК14 (рис. 1). Значение константы концентрации полумаксимального ингибирования (англ. half-maximal inhibitory concentration, IC50) 5-липоксигеназы было в несколько раз ниже для 7(ОН)МР (IC50 213±169 нМ), чем для молекул сравнения (IC50 608–887 нМ). Ингибирование синтеза провоспалительных простагландинов в каскаде арахидоновой кислоты неизбежно сопровождается снижением отека в каррагинановой модели (7(ОН)МР – на 56%, в контроле – на 6,4–37%).

Для 7(ОН)МР характерно ингибирование MAPK14 (IC50 261±292 нМ, контрольные молекулы: 376–425 нМ). Известно, что МАРК 11, 12, 13 и 14 участвуют в передаче сигнала от провоспалительных цитокинов, так что ингибиторы этих киназ – противовоспалительные средства [11].

Фармакопротеомное моделирование (т.е. хемореактомные оценки взаимодействий молекул с белками протеома) показало, что 7(ОН)МР может связываться с рецептором лейкотриена В4 (противовоспалительное действие), рецептором простагландина (противовоспалительное и вазодилаторное действие), прооксидантным ферментом гемоксигеназой-2. Высокие значения вероятности ингибирования получены для CDK3 и MAP3K2 (онкопротективное действие) (рис. 2а) [11]. На рисунке 2b приведены примеры сравнительных оценок различных фармакологических активностей 7(ОН)МР, связанных с ингибированием указанных белков.

Противовоспалительные эффекты 7(ОН)МР могут способствовать увеличению продолжительности жизни модельных животных. На рисунке 2с представлены хемореактомные оценки эффектов воздействия молекул на продолжительность жизни червей C. еlegans, мух дрозофил и мышей. Очевидно, что среди исследованных молекул именно 7(ОН)МР (в меньшей степени эпигаллокатехин-3-галлат) способствовал увеличению максимальной продолжительности жизни у C. еlegans и дрозофил. Только 7(ОН)МР существенно увеличивал медианную продолжительность жизни у мышей (+8%).

Таким образом, хемореактомное моделирование указало на противовоспалительную активность 7(ОН)МР, осуществляемую по различным молекулярным механизмам. Экспериментальные исследования подтверждают этот результат. В моноцитах 7(ОН)МР дозозависимо ингибировал синтез/секрецию фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α), а в гранулоцитах – снижал уровни активных форм кислорода и провоспалительного интерлейкина-8 [18]. 7(ОН)МР приводил к снижению ФНО-α-индуцированной адгезии моноцитов к эндотелиоцитам сосудов, снижению активации ядерного фактора каппа В (англ. nuclear factor kappa B, NF-κB) [19]. Также 7(ОН)МР дозозависимо тормозил ФНО-α-индуцированное фосфорилирование внеклеточной сигнально-регулируемой киназы ERK1/2 (или MAPK1/2) и Akt, что важно для замедления роста опухолевых клеток [2], повышал экспрессию ферментов антиоксидантной защиты [20].

Онкопротективные эффекты

Хемореактомное моделирование подтвердило наличие у молекул 7(ОН)МР прямых онкопротективных эффектов и позволило установить наиболее вероятные молекулярные механизмы их осуществления (рис. 3). Показаны более выраженный проапоптотический эффект в клетках НСТ116 (колоректальный рак) (7(ОН)МР: полумаксимальная эффективная концентрация (англ. half-maximal effective concentration, EC50) 59 нМ; контроль: EC50 972–1735 нМ), K562 (лейкемия миелоидная) (7(ОН)МР: увеличение апоптоза на 44%; контроль: 13–36%), антиангиогенная активность (7(ОН)МР: 65%; контроль: 5–6%) и торможение роста опухолей у мышей с солидной карциномой Эрлиха (СКЭ) (7(ОН)МР: на 27±15%; контроль: 5–7%) [11].

Хемореактомный анализ показал, что 7(ОН)МР может ингибировать CDK4 (Ki 1427 нМ; остальные: Ki>3000 нМ), EGFR (IC50 244 нМ; остальные: IC50 255–477 нМ), белка mTOR (IC50 632 нМ; остальные: IC50>2000 нМ) [11]. Ингибиторы CDK4 используются в терапии опухолей [21]. Ингибиторы EGFR применяются в лечении рака легких и прямой кишки [22]. Ингибиторы mTOR – группа онкопротективных средств, также проявляющих антигиперинсулинемические, противовоспалительные и геропротекторные свойства [23]. Таким образом, хемореактомный анализ демонстрирует выраженные онкопротективные эффекты 7(ОН)МР.

Хемотранскриптомный анализ и долговременные механизмы осуществления онкопротективных эффектов 7(ОН)МР / Chemotranscriptomic analysis and long-term mechanisms of 7(OH)MR oncoprotective effects

Хемореактомный анализ указал на возможные онкопротективные эффекты 7(ОН)МР, связанные с ингибированием белков протеома. Установление действия онкопротективных средств на транскриптом (т.е. совокупность мРНК всех генов, экспрессируемых в заданном типе клеток) – важная процедура постгеномной фармакологии, необходимая для комплексной оценки желательных и нежелательных эффектов лекарств. Значимой особенностью действия молекул – кандидатов на транскриптом является долговременность формируемых таким образом эффектов.

В результате проведения хемотранскриптомного анализа 7(ОН)МР влияние на экспрессию генов в клетках опухоли молочной железы (линия MCF7) было найдено для 27% изученных генов (3468 из 12700). Лигнан 7(ОН)МР снижал экспрессию пролиферативных генов (n=401), синтез и деградацию белка (n=266), энергетический метаболизм опухолевых клеток (n=91) и хроническое воспаление (n=148), повышая экспрессию генов онкопротективного иммунитета (n=100). Примеры функциональных групп генов, транскрипция которых достоверно изменялась, приведены на рисунке 4.

Установленные изменения транскрипции важны для следующих функций:

• уменьшение интенсивности внутриклеточного гомеостаза белков (что косвенно снижает синтез аденозинтрифосфата (АТФ));
• прямое снижение обеспеченности опухолевых клеток АТФ (сокращение транскрипции генов, функционирующих в митохондриях);
• ингибирование генов, непосредственно вовлеченных в пролиферацию (поддержание теломер, ремонт и репликация ДНК, деление клеток);
• ингибирование каскада NF-κB посредством предотвращения деградации белка Iκ-B, ингибирующего NF-κB;
• повышение транкрипции онкопротективных генов.

К белкам, кодируемым онкопротективными генами, относятся, в частности, интерферон-гамма (стимулирует апоптоз опухолевых клеток), ферменты биосинтеза тиреоидных гормонов (ингибируют рост онкоклеток линии MCF7) [24], рецепторные системы онкопротективных витаминов A, D и C (стимулируют апоптоз опухолевых клеток MCF7 [25]) и др.

В эксперименте онкопротективный эффект 7(ОН)МР наблюдался в дозе 5 мг/кг/сут [26]. Показано, что 7(ОН)МР и его метаболит энтеролактон уменьшают рост и метастазирование опухолей печени [27], предстательной железы [28], матки [29] и аденоматозной полипозной кишечной неоплазии [30]. Прием 30 мг/кг/сут 7(ОН)МР ингибировал рост опухолей молочных желез у крыс. Лигнан 7(ОН)МР уменьшал образование полипов и предотвращал накопление β-катенина в ядре (патофизиологическая метка образования полипов) [2][30].

Нами проведено экспериментальное исследование, показавшее, что 7(ОН)МР в дозах 60 и 120 мг/сут тормозит рост СКЭ даже при провокации эстрадиолом. Онкопротективный эффект 7(ОН)МР был сильнее выражен при использовании более высокой дозы (120 мг/сут): на 21-е сутки объем опухолевого узла снижался в среднем на 620 мм³ по сравнению с контролем (р=0,00036). Анализ динамики опухолевого узла продемонстрировал, что применение 7(ОН)МР замедляет скорость роста опухолей. Прием 120 мг/сут 7(ОН)МР достоверно тормозил интенсивность роста опухолевого узла на фоне применения эстрогенов [11]. Различия были статистически достоверны на 10-е, 13-е, 17-е и 21-е сутки [31].

В частности, в рамках анализа выживаемости мышей при приеме 7(ОН)МР у единичных особей отмечалось существенное повышение продолжительности жизни (рис. 5). В 2 случаях из 14 животные, получавшие 7(ОН)МР в дозе 120 мг/сут на фоне приема эстрадиола, выживали в течение 3 мес после начала эксперимента. В контроле все животные погибли через 90 сут от начала эксперимента. Данный результат интересно сопоставить с результатами хемореактомного анализа, показавшего выраженное влияние 7(ОН)МР на увеличение продолжительности жизни модельных животных (см. рис. 2с). Таким образом, препарат 7(ОН)МР в дозах 60 и 120 мг/кг/сут оказывает достоверное онкопротективное воздействие при СКЭ [31].

Результаты хемотранскриптомного моделирования 7(ОН)МР (клетки линии MCF7, рак молочной железы), подтвержденные результатами хемореактомного анализа молекулы и экспериментальными данными [31], также согласуются с результатами клинического исследования 7(ОН)МР у пациенток в предраковом состоянии – с фиброзно-кистозной мастопатией (ФКМ) [32]. Прием 7(ОН)МР в дозе 60 мг/сут (длительность курса 1 мес) приводил к нормализации метаболизма эстрогенов и улучшению клинической симптоматики ФКМ. Анализ метрических диаграмм, указавший на существование кластера высококоррелирующих между собой параметров при применении 7(ОН)МР, позволяет утверждать, что 7(ОН)МР способствует улучшению координации метаболизма различных эстрогенов [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Онкопротективные и противовоспалительные свойства 7(ОН)МР, специфического лигнана ели обыкновенной, обусловливают целесообразность его использования в клинической практике онкологов и гинекологов.

По данным хемоинформационного анализа 7(ОН)МР, схожие с ним молекулы характеризуются онкопротективным, антибактериальным, противовирусным, гепатопротекторным, противовоспалительным, вазодилатирующим, гиполипидемическим, антитромботическим, антиоксидантным, противодиабетическим и нейропротекторным эффектами. Хемотранскриптомный анализ 7(ОН)МР в опухолевых клетках рака молочной железы (MCF7) продемонстрировал снижение транкрипции генов пролиферации, синтеза и протеасомной деградации белков, энергетического метаболизма и воспаления при повышении экспрессии онкопротективных генов. Экспериментальные исследования 7(ОН)МР показали достоверное снижение объема опухолевого узла даже при провокации эстрадиолом. Лигнан 7(ОН)МР, влияя на профиль микроэлементов, способствует снижению опухолевых рисков, связанных с гиперэстрогенией при мастопатии.

Таким образом, 7(ОН)МР является перспективной молекулой – кандидатом для лечения ФКМ и профилактики рака молочной железы, особенно в климактерическом периоде.