Проблемы использования фенола (гидроксибензола) и парабенов в качестве стабилизаторов фармацевтических средств: анализ с применением методов машинного обучения

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Фенол (также известный как «карболовая кислота») представляет собой ароматический спирт (соединение с гидроксильной группой –ОН) с молекулярной формулой C₆H₅OH, обладающий характерным резким и въедливым запахом. Несмотря на то что фенол является спиртом, при растворении в воде данное вещество действительно образует кислые растворы (рН 6,5), которые при высоких концентрациях вызывают химические ожоги.

В более широком смысле слово «фенол» также используется для обозначения любого соединения, которое содержит шестичленное ароматическое кольцо, непосредственно связанное с гидроксильной группой –ОН. Таким образом, фенолы представляют собой класс органических соединений, простейшим представителем которого является собственно фенол – C₆H₅OH (рис. 1).

В органической химии фенол впервые был извлечен в процессе переработки угля. В настоящее время он является одним из сотен продуктов переработки нефти и применяется в органическом синтезе (производство пластмасс, поликарбонатов, эпоксидных смол, материалов типа бакелит, текстолит, гетинакс, нейлон, моющих средств, гербицидов), медицине (как антисептик, антигрибковый препарат, анестетик при отологических процедурах) и фармацевтике (молекула-предшественник для синтеза салициловой кислоты, стабилизатор отдельных препаратов природного происхождения).

В исторической перспективе фенол использовался как антисептик (в т.ч. внутриматочный) со второй половины XIX века. Несмотря на то что его бактерицидный эффект по механизму схож с действием тепла (E.A. Cooper, 1912 г.) [1], установлена устойчивость к фенолу стафилококков (G.F. Reddish, 1925 г.) [2], а потом и других бактерий: Micrococcus pyogeis var. aureus [3][4]. В частности, бактерии Rhodococcus Phenolicus и Cryptanaerobacter phenolicus вообще могут использовать фенол как единственный источник углерода (т.е. буквально «питаться» им). Вирус энцефаломиелита устойчив к фенолу: в 1% растворе фенола вирус сохраняет активность в течение 5 нед [5].

Существует и ряд курьезных «медицинских применений» данного вещества. Например, один британский ученый в 1936 г. использовал 98,5% водный раствор фенола для подкожного введения в плечо в качестве «лечения простуды у больных туберкулезом легких» [6]. Другой пример: фенол использовался для «местной анальгетической терапии», осуществляемой на самом деле посредством разрушения фенолом болевых нервов [7]. Сообщалось также об облегчении боли при болезни Педжета путем инъекции фенола в симпатические нервы с их последующей деструкцией [8]. Такого рода курьезы напоминают не только об использовании так называемой каломели (HgCl₂) в качестве панацеи в период темного европейского средневековья, но и о более недавних экспериментах на людях: инъекции фенола (порядка 1 г) применялись в качестве средства для индивидуальных казней в нацистской Германии, в т.ч. в ходе массовой экстерминации инвалидов [9].

С начала ХХ века фенол использовался для стабилизации препаратов природного происхождения (инсулина и др. – см. далее) [10]. Напомним, что характерной особенностью фенола как консерванта является сильный, резкий и легко узнаваемый запах («пахнет карболкой»). Поскольку фенол проявил в общем-то неплохие качества как антисептик и/или консервант против некоторых бактерий, для устранения коммерчески невыгодной особенности («запах карболки») стали активно проводиться эксперименты с введением карбоксильной группы (–СООН) в пара-(4)-положение бензольного кольца (т.к. в органической химии давно известно, что бензойная кислота имеет гораздо более слабый запах, чем фенол). Кроме того, введение карбоксила позволяет регулировать не только запах, но и гидрофобность, другие химические и биологические свойства путем образования сложных эфиров пара-(4)-гидроксибензойной кислоты (ПГБК) с различными простыми спиртами (метиловым, этиловым, пропиловым, бутиловым, бензиловым и др.). Этим молекулам дали название «парабены» – очевидно, имея в виду пара-положение карбоксила в 4-гидроксибензойной кислоте (см. рис. 1).

В настоящее время парабены все еще применяются как консерванты для пищи, косметики и фармацевтических препаратов, т.к. проявляют родственные фенолу антисептические и фунгицидные свойства. Они входят в регистр пищевых добавок под идентификаторами E218 (метилпарабен), E214 (этилпарабен), E216 (пропилпарабен), E209 (гептилпарабен) и др. ПГБК синтезируют из фенола, а парабены получают в результате этерификации ПГБК соответствующими спиртами. В организме человека возможны взаимопревращения фенола и парабенов (в т.ч. с участием микробиома), в частности гидролиз парабенов и их аэробная трансформация в фенол посредством энтеробактерий человека [11].

Вследствие фенолоподобных противомикробных свойств парабенов на фоне более слабого запаха они повсеместно используются в качестве консерванта в пищевых продуктах, средствах личной гигиены и фармацевтических препаратах, в результате чего постоянно попадают в окружающую среду при смывании косметики или утилизации отходов фармацевтической, пищевой и бумажной промышленности. Парабены были обнаружены в домашней пыли, сточных водах, поверхностных водах рек, они способствуют загрязнению морской воды. Токсическое действие парабенов включает канцерогенез, бесплодие, нарушения эндокринной активности, сперматогенеза, адипогенеза, эмбриогенеза и аллергию. Чтобы утверждать, что парабены безопасны для использования в том виде, в каком они сейчас применяются в косметической, пищевой и фармацевтической промышленности, необходимо учитывать все аспекты токсикологии этих соединений [12].

Цель – провести анализ результатов фундаментальных и клинических исследований по хронической токсичности фенола и парабенов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Методология поиска публикаций / Publication search methodology

Несмотря на кажущийся большим объем научных исследований по токсичности фенола и парабенов (например, по запросу “Phenols/toxicity [MeSH Terms] AND (Drug OR pharmacology)” в базе данных PubMed/MEDLINE найдено 19 306 публикаций, по аналогичному запросу по парабенам – 1530 статей), подавляющее большинство этих работ не имеют ничего общего с фенолом или парабенами, а касаются совершенно иных соединений, содержащих гидроксибензоловые фрагменты.

При анализе результатов запроса “Preservatives, Pharmaceutical [MeSH Terms]” (3314 публикаций) почти четверть работ (795) затрагивает вопросы исследования токсичности и побочных эффектов фармацевтических консервантов (в т.ч. аллергических реакций). В качестве стабилизаторов лекарств исследуются не только парабены и гидроксибензол, но и хлориды бензалкония (антисептик, оказывающий противогрибковое, вирулицидное, антипротозойное действие) и даже ртутьсодержащее соединение тимеросал.

Указанные выборки публикаций крайне неоднородны, включают существенно разные профили токсикологии фенола/парабенов, хлоридов бензалкония и других веществ с антисептическими свойствами. Поэтому в настоящей работе мы остановились на выборке, полученной по запросу “Preservatives, Pharmaceutical [MeSH Terms] AND Phenol [MeSH Terms]”, – найдено 544 статьи. Парабены являются производными фенола, поэтому публикации по парабенам всегда аннотируются ключевым словом «фенол». В данной выборке большинство публикаций относилось именно к свойствам парабенов.

Методы анализа / Methods of analysis

Проведен системный компьютерный анализ массива публикаций с использованием методов топологического и метрического анализа больших данных, разрабатываемых в научной школе академика РАН Ю.И. Журавлёва и неоднократно описанных на страницах журнала [13].

Анализ основан на нахождении наиболее информативных терминов (ключевых слов, их сочетаний, рубрик Международной классификации болезней 10-го пересмотра, разделов международной номенклатуры Gene Ontology и др.) при сравнении выборки литературы с контрольной выборкой публикаций по биомедицине (с целью устранения чересчур общих ключевых слов наподобие «медицина», «терапия» и тысяч других). В качестве контрольной использовалась выборка из 544 текстов, случайно отобранных из массива 881 645 публикаций, найденных по запросу “Pharmaceutical [MeSH Terms] NOT Preservatives NOT Phenol” в базе данных PubMed/MEDLINE.

Все ключевые слова сортировались по эмпирическим функционалам информативности Рудакова–Торшина в контексте комбинаторной теории разрешимости [14]. Затем проводилось комбинаторное тестирование условия разрешимости (как описано в [14]), чтобы из списка терминов выделить только те, которые обладают наибольшей информативностью и принципиально необходимы для выполнимости условия разрешимости. В результате анализа литературы выявлено 65 наиболее информативных биомедицинских терминов, отличающих тексты исследований по теме от публикаций в контроле. На основании данного списка терминов осуществлялся дальнейший поиск и отбор источников для обзора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Направления исследований фенола и парабенов / Research directions for phenol and parabens

Проведенный анализ позволил разделить публикации по различным аспектам исследования фенола и его производных как фармацевтических консервантов на пять рубрик:

– острая токсичность;

– функция биомаркеров крови;

– эстрогеноподобное действие;

– риски опухолевых заболеваний;

– тератогенное и прочее токсическое воздействие на эмбрион и беременность.

Острая токсичность

Токсичность фенола изучалась редко – как правило, сообщалось только о тяжелых случаях [15] или промышленной патологии с отравлением фенолом либо его производными [16]. Представленные в настоящей работе результаты анализа литературы по данному вопросу позволяют утверждать, что долговременная (хроническая) токсичность фенола и, особенно, его производных (парабены и др.) остается практически не изученной. На этот факт постоянно указывают и производители соответствующих веществ в паспортах безопасности (см., например, паспорта безопасности фенола [17] и пропилпарабена [18]).

По показателям острой токсичности даже сам фенол относится к 3-й категории «Вещества умеренно опасные». В самом деле, у крыс значения полумаксимальной летальной дозы (англ. half-maximal lethal dose, LD50) достаточно высоки (перорально 340 мг/кг, ингаляционно более 900 мг/м³, дермально 660 мг/кг). Однако по отношению к гаметоцитам (так называемая мутагенность зародышевой клетки), показателям специфической токсичности, опасности в водной среде и по предельно допустимым концентрациям (ПДК) в воздухе (0,3 мг/м³) фенол относится ко 2-й категории «Вещества высокоопасные» (при работе с веществом требуется специальная защита кожи и глаз) [17]. Фенол и его производные (парабены, хлорфенолы и др.), используемые как антибактериальные консерванты, провоцируют гемолиз эритроцитов [19].

У людей воздействие фенола вызывает раздражение кожи, глаз, носа, горла, потерю массы тела, слабость, истощение, мышечные боли, раздражительность, повреждения печени и почек, ожоги кожи и судороги. Фенол и его пары разъедают глаза и кожу (феноловый дерматит) [20]. Вдыхание паров фенола может вызвать отек легких, приводит к аритмии и судорогам, они гепато- и нефротоксичны [21][22]. Поскольку фенол сравнительно быстро всасывается через кожу, то помимо местных едких ожогов может возникнуть системное отравление. LD50 при пероральной токсичности составляет менее 500 мг/кг для собак, кроликов или мышей; минимальная смертельная доза для человека – 140 мг/кг [23]. Токсическое действие фенола на центральную нервную систему вызывает внезапный коллапс и потерю сознания как у людей, так и у животных. Этим симптомам предшествует состояние спазмов из-за двигательной активности, контролируемой центральной нервной системой [23].

По показателям острой токсичности парабены выглядят намного безопаснее. Например, для пропилпарабена у крыс per os LD50 составляет более 5000 мг/кг, а данных по ингаляционной и дермальной токсичности не имеется. При интоксикации повторными дозами уровень ненаблюдаемого вредного воздействия (англ. no observed effect concentration, NOEC) более 1000 мг/кг. ПДК в воздухе – более 10 мг/м³, что формально относит пропилпарабен (как, впрочем, и другие парабены) к 4-й категории «Малоопасные вещества» [18].

В то же время показатели экотоксичности фенола и парабенов, особенно в водной среде, относят их к характеристике опасности H411 «Токсично для водных организмов с долгосрочными последствиями». Например, полумаксимальная летальная концентрация (англ. half-maximal lethal concentration, LC50) фенола для радужной форели (Oncorhynchus mykiss) составляет 8,9 мг/л [17]. Сопоставимые значения получены для пропилпарабена в случае Danio rerio (рыбка-зебра) – 6,4 мг/л [18]. Токсичность фенола по отношению к дафнии (Ceriodaphnia dubia) и другим водным беспозвоночным выше (полумаксимальная эффективная концентрация (англ. half-maximal effective concentration, ЕС50) 3,1 мг/л) [17], чем у пропилпарабена (EC50 15,4 мг/л) [18], а токсичность по отношению к морским водорослям Pseudokirchneriella subcapitata, наоборот, выше в случае пропилпарабена (EC5 16 мг/л), чем фенола (EC50 61,1 мг/л) [17]. Таким образом, экотоксичность фенола и парабенов по крайней мере сопоставима.

Аллергия на парабены давно известна [24]. Описаны случаи контактного дерматита при использовании парабенов в качестве консервантов в глазных каплях [25]. Пероральная провокация парабенами у пациентов с чувствительностью к ним весьма наглядна: достаточно 100 мг метилпарабена и 100 мг пропилпарабена, чтобы вызвать обострение экземы или дерматита [26].

В двойном слепом рандомизированном исследовании отмечены анафилактоидные кожные реакции после внутривенной региональной анестезии с использованием 0,5% прилокаина с консервантом метилпарабеном (n=100) при сравнении с инъекциями без этого консерванта (n=100). У 17 пациентов в группе с метилпарабеном и только у 4 пациентов в группе без парабена развились эритематозные кожные реакции на внутренней поверхности предплечья после снятия жгута (р<0,05) [27].

Функция биомаркеров крови

Крайне слабо изучены ассоциации между уровнями фенолов и парабенов в крови с различными показателями здоровья у пациентов в поперечных и продольных эпидемиологических исследованиях. С одной стороны, фенол является нормальным продуктом обмена веществ, у человека выводится с мочой в количестве до 40 мг/л [23]. Достаточно давно известно, что уровень фенола в крови повышается на фоне уремии [28] и при почечной недостаточности [29]. Содержание фенола в крови и других биосубстратах повышается после местного применения фенолсодержащих препаратов [30], а также вследствие профессиональных или экологических рисков.

Например, увеличение концентрации фенола (в логарифмической шкале) в моче работников коксовых печей было достоверно ассоциировано с повышением уровня мочевой кислоты (+9,8 мкмоль/л; 95% доверительный интервал (ДИ) 2,20–17,47) и холестерина (+0,1 ммоль/л; 95% ДИ 0,0–0,2) в сыворотке крови [31]. Вследствие биотрансформации бензола в фенол, катализируемой внутриклеточным цитохромом P450 BM3 [32], существует связь между концентрацией фенола в моче и содержанием бензола в атмосфере [33]. Метаболическая активация фенола миелопероксидазой человека в 4,4'-бифенол и дифенохинон играет важную роль в гематопоэтической токсичности, наблюдаемой при хроническом воздействии бензола [34].

Основные метаболиты парабенов в организме человека включают пара-гидроксибензойную кислоту, пара-гидроксигиппуровую кислоту, пара-гидроксибензойный глюкуронид. Поскольку парабены являются ярко выраженными ксенобиотиками, их уровни в крови указывают на активное употребление парабеносодержащих средств (фармацевтических, косметологических) или на неблагоприятную экологическую обстановку (например, загрязнение парабенами водных источников).

Эстрогеноподобное действие

Многие лосьоны для местного применения, солнцезащитные кремы и лекарства содержат парабены в качестве консервантов, которые могут легко проникать через роговой слой в эпидермальный отдел кожи. Парабены ингибируют активность эстрогенсульфотрансферазы кожи человека, что обеспечивает возможную связь с эстрогенными эффектами парабенов.

Эффективность ингибирования сульфотрансферазы повышается по мере увеличения длины цепи сложного эфира парабена. Обнаружено, что бутилпарабен является наиболее активным из парабенов в цитозоле кожи: полумаксимальная концентрация ингибирования (англ. half-maximal inhibitory concentration, IC50) 37±5 мкМ. Бутилпарабен блокирует сульфатирование эстрадиола и эстрона в цитозоле кератиноцитов (но не андрогена дегидроэпиандростерона), что соответствует пролонгированному эстрогеноподобному эффекту. В результате парабены могут напрямую взаимодействовать с рецепторами эстрогенов. Кроме того, ингибируя сульфатирование эстрогенов в коже, парабены косвенно усиливают эстрогенные эффекты за счет повышения уровня эстрадиола [35].

Бутилпарабен оказался самым мощным ингибитором сульфатирования эстрадиола в коже (IC50 37±5 мкМ) – сульфатация полностью блокировалась 1 мМ бутилпарабена. Фракции печени демонстрировали в 18 раз более высокую скорость сульфатирования эстрадиола, чем кожа. В печени значения IC50 для метилпарабена, этилпарабена, пропилпарабена и бутилпарабена составили 330±140, 80±40, 30±5 и 21±5 мкМ соответственно [35].

Вмешательство парабенов в молекулярные эффекты эстрогенов наглядно иллюстрируется тем, что парабены ингибируют раннюю фазу фолликулогенеза и стероидогенеза в яичниках новорожденных крыс. Новорожденным самкам (n=55) ежедневно вводили подкожные инъекции метил-, пропил- и бутилпарабена или 17-бета-эстрадиола (Е2) в течение 1–7-го дней новорожденности. При высоких дозах пропил- и бутилпарабена число примордиальных фолликулов увеличивалось, тогда как число ранних первичных фолликулов уменьшалось [36].

Примордиальные, ранние первичные и первичные фолликулы характеризовались гистологической морфологией гранулезных клеток и ооцита. Примордиальные фолликулы содержали ооцит, окруженный уплощенными плоскими прегранулезными клетками, ранние первичные фолликулы – недифференцированный и неполный слой кубовидной формы и гранулезные клетки (рис. 2), а первичные фолликулы имели полный однослойный кубовидный слой [36].

Продукты биотрансформации бензилпарабена, бензилпарабен-о-фенола и бензилпарабен-м-фенола проявляли в 10 раз более высокую проэстрогенную активность (в наномолярном диапазоне концентраций, IC50 300–500 нМ) по сравнению с самим бензилпарабеном (IC50 6400 нМ) [37]. Бутилпарабен и пропилпарабен модулируют концентрацию димера фенола, бисфенола А (БФА) и эстрадиола у самок и самцов мышей (линия CF1). Мышам вводили физраствор, 3 мг бутилпарабена или 3 мг пропилпарабена и через 2–12 ч в моче измеряли уровень эстрадиола. В то время как пропилпарабен слабо влиял на эстрадиол, бутилпарабен значительно повышал его уровни через 6–10 ч после инъекции у самок и через 8 ч после инъекции у самцов [38].

Димер фенола БФА также проявляет эстрогеноподобные свойства, связываясь эстрогеновым рецептором гамма (англ. еstrogen-related receptor gamma, ERRγ) человека. На основании рентгеноструктурного анализа комплекса лиганд-связывающего домена рецептора ERRγ с БФА показано, что аминокислотные остатки Glu275 и Arg316 рецептора ERRγ функционируют как сайт внутреннего связывания фенолгидроксильной группы БФА (т.е. фрагмента БФА, идентичного по структуре фенолу). Водородные связи фенол-Glu275 и фенол-Arg316 стабилизируют фенольное кольцо в связывающем кармане рецептора. Мутагенез кармана рецептора показал, что аминокислотные остатки Leu268, Leu271, Leu309 и Tyr326, в дополнение к Glu275 и Arg316, являются существенной частью фенол-связывающего кармана, а Ile279, Ile310 и Val313 структурно поддерживают карман-образующие остатки, обеспечивая прочное связывание фенольного кольца с ERRγ (рис. 3) [39]. Из полученных данных очевидно, что карман эстрогенового рецептора, участвующий в связывании БФА, также может связывать и молекулу фенола.

Следует подчеркнуть, что фенол/парабены ни в коей мере не представляют собой «аналоги эстрогенов». Вмешиваясь в метаболизм эндогенных эстрогенов, эти молекулы, скорее, являются нарушителями обмена эстрогенов с эффектами, существенно отличными от эффектов эстрогенов.

В частности, эстрадиол регулирует экспрессию генов KIT, STAR и CYP11A1, но не влияет на уровни антимюллерова гормона (АМГ) и гена FOXL2. В то же время под действием пропил- и бутилпарабенов повышались уровни АМГ (вырабатываемого зрелыми фолликулами и действующего как ингибитор фолликулогенеза) и экспрессии гена FOXL2 (регулирующего дифференцировку гранулезных клеток и поддерживающего рост преовуляторных фолликулов). Под действием бутилпарабена повышалась экспрессия фактора стволовых клеток KITL (фактор роста яичников) [36].

После обработки метил-, пропил- и бутилпарабенами значительно снижались уровни экспрессии стероидогенного белка-регулятора STAR (транспортного белка, контролирующего перенос холестерина внутри митохондрий, что является лимитирующей стадией в биосинтезе стероидных гормонов) и фермента CYP11A1 (расщепляющего боковую цепь холестерина) [36].

Таким образом, эстрадиол и парабены по-разному влияют на регуляцию фолликулогенных и стероидогенных генов, так что парабены проявляют как эстрогеноподобные, так и неэстрогенные свойства. Уровни стероидогенных ферментов, индикаторов дифференцировки фолликулов, по-видимому, регулируются парабенами посредством ингибирования их репрессора транскрипции FOXL2 [36].

Приведенный выше анализ взаимодействий парабенов и других производных фенола с эстрогеновыми рецепторами позволяет сформулировать гипотезу о том, что фармакофором токсичности парабенов является фенильная группа. В самом деле, и метил, и этил-, и пропил-/изопропил-, и бутил/изобутил-парабены токсичны, так что замена короткого хвоста спирта (1 атом цикла, метил) на более длинные не только приводит к снижению токсичности, но и может увеличивать ее. Вследствие весьма разных размеров (1–4 атома, т.е. от 0,4 до 1,6 нм) маловероятно, что все эти парабены связываются одним и тем же набором целевых белков через «парабеновую» группу –COOR (R=Me, Et, Pr, Bu). Эти же хвосты не могут разместиться, например, в рассмотренной выше структуре эстрогенового рецептора (см. рис. 3). Соответственно, роль сложного эфира – хвоста состоит не в повышении специфичности взаимодействия с белками, а в обеспечении различной степени донорства электронной плотности в пи-систему фенольной группы (которая и осуществляет свое токсичное воздействие через взаимодействия фенольного фармакофора с белками протеома).

Показаны антиандрогенные свойства парабенов и других молекул, содержащих фенольный фармакофор. В концентрации 10 мкМ метил-, пропил- и бутилпарабены in vitro ингибировали тестостерон-индуцированную транскрипционную активность на 40%, 33% и 19% соответственно (р<0,05) [40].

Патофизиология опухолевых заболеваний

Метилпарабен, нанесенный на кожу, взаимодействует с ультрафиолетом, способствуя старению кожи и повреждению ДНК [41]. Установлена значительная связь между более высоким уровнем фенола и парабенов в образцах мочи и более высокими уровнями экспрессии онкогенов BUB1B, TOP2A, UBE2C, RRM2 и CENPF на агрессивных стадиях рака простаты (более 8 баллов по шкале Глисона) [42]. Высокая концентрация парабенов была обнаружена в раковых опухолях (например, в 18 из 20 случаев рака молочной железы [43]), что может быть связано с чрезмерно частым применением парабеносодержащих антиперспирантов, дезодорантов и т.п. [44].

При воздействии низких доз производных фенола (метилпарабен, триклозан) у крыс в критические периоды развития наблюдаются изменения в гистологии молочной железы и профилях транскриптома. Длительное воздействие парабенов от рождения до лактации было связано с увеличением жировой ткани и уменьшением количества железистой и секреторной ткани, а также с изменениями экспрессии 993 генов, участвующих в таких путях, как синтез холестерина и адипогенез. Гены, на экспрессию которых влиял метилпарабен, были чрезмерно представлены в сигнатурах генов рака молочной железы, что указывает на возможную связь с канцерогенезом [45].

Срезы молочной железы окрашивали трихромом Массона для оценки распределения коллагена в строме и определения относительной доли каждого типа ткани (железистой, жировой, соединительной и секреторной) на каждой стадии развития железы в контрольной и основной группах (рис. 4). Молочные железы от перинатального до пубертатного периода имели оценку 0 для секреторной ткани у всех исследованных животных – следовательно, показан только компонент секреторной ткани крыс, получавших лечение в течение длительного времени (от рождения до лактации). На каждой стадии развития в контрольных молочных железах наблюдались различные гистологические особенности. В перинатальном окне (рис. 4a, 4b) паренхима была рудиментарной, а стромальный отсек был заполнен адипоцитами. Каждая ветвь состояла из одного слоя эпителиальных клеток, окружающих центральный просвет. Препубертатные молочные железы (рис. 4e, 4f) имели разбросанные протоки, выстланные одним или двойным слоем кубовидного эпителия, который становился многослойным, образуя концевые зачатки, состоящие из трех-шести слоев эпителиальных клеток. Высокие темпы пролиферации клеток связаны с увеличением количества клеток в концевых зачатках. В пубертатных железах (рис. 4i, 4j) отмечено усиленное боковое ветвление и образование альвеолярных зачатков, а дольки сложных разветвленных альвеолярных желез были разделены плотной междольковой соединительной тканью и жиром. На рисунках 4m, 4n альвеолы расширились, заполнив железу; по мере установления лактации на этом этапе жир в адипоцитах метаболизировался и происходила мобилизация жира из адипоцитов в эпителиальные клетки альвеол. Одновременно наблюдалось уменьшение количества внутри- и междольковой соединительной ткани. У животных, получавших метилпарабен, в перинатальном окне было значительно уменьшено количество жировой ткани и увеличено расширение дерева протоков внутри жировой подушки (рис. 4c). Препубертатное применение метилпарабена также было связано со значительным уменьшением жировой ткани и увеличением количества железистой ткани (рис. 4g). У пубертатных животных метилпарабен значительно увеличивал количество железистой ткани по сравнению с контролем, что видно по более высокой степени ветвления относительно общей площади желез (рис. 4k) [45].

Воздействие на эмбрион и беременность

Проспективное исследование беременных в первом триместре (n=221) продемонстрировало, что более высокие концентрации 2,5-дихлорфенола соответствовали увеличению риска прерывания беременности на ранних сроках (отношение шансов (ОШ) 4,8; 95% ДИ 1,1–21) [46]. Воздействие фенолов, парабенов и фталатов на плод стимулирует развитие ожирения у ребенка в более позднем возрасте [47].

Пренатальный эффект фталатов, парабенов и фенолов также связан с повышением риска астмы, ухудшения функции легких и развития аллергии на дыхательные стимулы [48]. Метаболомный анализ мочи беременных (n=88) показал, что парабены нарушают метаболизм пуринов, бета-окисление жирных кислот и регуляцию других биохимических маршрутов [49].

Парабены отрицательно влияли на уровни свободного трийодтиронина (Т3) и соотношение Т3/Т4 (общий тироксин) [50]. У беременных женщин снижался общий Т3 на фоне увеличения бензофенона-3 (–2,1%; 95% ДИ –4,2…0,0) и бутилпарабена (–2,8%, 95% ДИ –5,3…–0,3) [51]. Концентрация фенола в моче матери и ребенка влияют на функцию щитовидной железы у новорожденных и поведенческие проблемы в возрасте до 10 лет. Концентрация БФА в материнской моче была достоверно ассоциирована с повышенным риском когнитивных нарушений по опроснику SDQ¹ (ОШ 1,45; 95% ДИ 1,07–1,97), а уровни бензофенона-3 – с ухудшением социального поведения (ОШ 1,6; 95% ДИ 1,0–2,4) в возрасте 10 лет [52].

В пренатальном периоде фенол и парабены влияют на развитие нервной системы [53], включая усиление патофизиологии расстройств аутистического спектра [54]. Обследование детей в возрасте 6–8 лет (n=446) показало, что повышенные концентрации пропилпарабена в моче были ассоциированы с более высокими баллами по шкале K-CPT-2² [55].

Пропилпарабен снижает возбудимость нейронов гиппокампа, блокируя натриевые каналы [56]. Фенол и его хлор-производные повышали цитозольный уровень ионов кальция в эритроцитах человека, стимулировали активацию каспазы-3 и кальпаина, что соответствует инициации фенолами апоптоза эритроцитов [57]. Хроническое воздействие пропилпарабена на эмбрионы и мальков рыбок Danio rerio вызывает развитие долгосрочной нейротоксичности [58].

В последнем исследовании эмбрионы Danio rerio подвергались воздействию двух разных концентраций парабена (10 и 1000 мкг/л, что соответствует потреблению парабена в количестве примерно 0,05–5 мг/сут). Затем оценивались поведенческие фенотипы мальков (поведение в открытом поле, реакция на испуг, циркадианная ритмичность) и экспрессия генов в мозге (в т.ч. CYP19A1B, PAX6A, SHANK3A и GAD1B). Пропилпарабен подавлял экспрессию генов SHANK3A (морфогенез мозга и плавательное поведение, глутамергическая нейротрансмиссия) и GAD1B (глутаматдекарбоксилаза 1b), что указывает на негативное влияние на синаптогенез и развитие нервной системы. Протеомный анализ выявил изменения, связанные с нарушениями обмена липидов [58].

Анализ токсичности парабенов на червях C. elegans позволил получить оценки LD50 при 72-часовом воздействии (от стадии личинки до стадии взрослой особи). Значения LD50 для метил-, этил-, пропил-, бутилпарабена составили 278, 218, 169 и 132 мкг/мл соответственно (рис. 5) [59]. Хроническое воздействие на C. elegans более низкими дозами парабенов (1/5 LD50) приводило к возрастанию внутренней концентрации парабенов почти в 2 раза (от 1,67 до 2,83 мкг/г сухой массы организма). Токсичность парабенов в отношении выживаемости, роста, поведения и размножения C. elegans убывала в ряду бутилпарабен → пропилпарабен → этилпарабен → метилпарабен. У червей, подвергшихся воздействию парабенов, наблюдались значительное снижение активности гена вителлогенина (основного белка ооцита, который транспортирует белки и липиды), высокий уровень активных форм кислорода (АФК) и повышение экспрессии антиоксидантных ферментов на фоне нарушений ядерной локализации регуляторного белка DAF-16 и абнормальной активации сигнальных белков HSF-1 и SKN-1. Следовательно, парабены вызывают эндокринные нарушения, окислительный стресс и токсичность у C. elegans при воздействии в период роста от стадии личинки [59].

Сравнительный транскрипционный анализ метилпарабена (100 мкМ) и пропилпарабена (10 мкМ) у рыбок Danio rerio показал, что оба парабена дозозависимо токсичны для эмбрионов, приводя к аномалиям развития (дефекты позвоночника, отек перикарда, дефекты пигментации), задержке вылупления и повышению смертности. По тератогенному эффекту и смертности пропилпарабен оказался более токсичным, чем метилпарабен. Анализ экспрессии генов при еще более низких дозах (1 и 10 мкМ) продемонстрировал нарушение регуляции генов, участвующих в реакции на стресс, клеточном цикле и повреждении ДНК, воспалении, метаболизме жирных кислот, эндокринных функциях. В частности, парабены вызывают окислительный стресс, разрывы ДНК, апоптоз. Изменения экспрессии рецепторов андрогенов и эстрогенов указывают на антиандрогенную и эстрогенную активность парабенов [60].

Пороки развития эмбрионов и мальков Danio rerio наблюдались после воздействия метилпарабена (100 мкМ) и пропилпарабена. Эмбрионы дозозависимо светлели в ответ на пробилпарабен (≥25 мкМ) (рис. 6). Воздействие на эмбрионы 50 и 100 мкМ пропилпарабена выявило аномальную морфологию через 72 ч после оплодотворения, а позже, через 96 ч после оплодотворения, эмбрионы сморщились, что привело к 100% смертности. Через 96 ч после оплодотворения воздействие метилпарабена в концентрациях 50, 100 и 200 мкМ вызывало пороки развития (в т.ч. отек перикарда и дефекты позвоночника) [60].

Метил- и бутилпарабены в дозах 100 и 200 мг/кг отрицательно влияют на ферменты антиоксидантной системы, вызывая генотоксичность в семенниках крыс и способствуя развитию мужского бесплодия. Введение парабенов не влияло на потребление воды и пищи, но приводило к статистически значимому снижению массы семенников и семенных пузырьков, особенно в случае бутилпарабена. Отмечено увеличение активности каталазы, супероксиддисмутазы при снижении активности глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы. Таким образом, наблюдалось увеличение перекисного окисления липидов, которое было наиболее значительным в случае бутилпарабена [61].

Метил-, этил-, пропил- и бутилпарабен генерируют АФК в сперматозоидах человека, дозозависимо ингибируя подвижность и жизнеспособность сперматозоидов. В концентрации, используемой в клинических условиях, метилпарабен ингибировал подвижность сперматозоидов после 2 ч воздействия и, особенно, после 5 ч (p<0,05), снижая жизнеспособность клеток (p<0,01), одновременно увеличивая выработку АФК и окислительное повреждение ДНК [62].

Эпидемиологические исследования показали, что воздействие парабенов на беременную провоцирует развитие избыточного веса у детей. Для бутилпарабена установлена положительная связь с избыточным весом в течение первых 8 лет жизни (особенно у девочек). В эксперименте парабены вызывали более высокое потребление пищи беременными мышами и повышение веса мышат на фоне увеличения размера адипоцитов. Этот эффект сопровождался нарушениями эпигенетического метилирования регуляторных участков промотера гена POMC (проопиомеланокортина), снижая его экспрессию в гипоталамусе (что соответствует нарушению метаболизма энкефалинов и опиоидной нейротрансмиссии) [63].

Использование фенола и парабенов в стабилизации фармацевтических препаратов природного происхождения / The use of phenol and parabens for stabilizing pharmaceuticals of natural origin

Как известно, к препаратам для внутривенного и внутримышечного введения предъявляются особые требования по очистке от тяжелых металлов, содержанию таких консервантов, как хлорид натрия, антигенов животного происхождения, фенолов, парабенов и других ксенобиотических веществ. При производстве препаратов из природного сырья эти требования особенно важны, т.к., например, следы фенола в рыбе указывают на неблагоприятную экологическую среду ее обитания.

Ранее фенол использовался для стабилизации практически всех коммерчески доступных препаратов инсулина, которые, стабилизируя молекулу инсулина, приводили к нежелательной токсичности для тканей печени [10]. Фенол применялся для стабилизации вакцин [64], но вследствие очевидного денатурирующего эффекта, сходного с действием тепла [1], оказывал повреждающее воздействие на их белковые антигены [65].

Современные технологии производства препаратов из животного сырья исключают внесение в них фенола. Степень очистки и способ стабилизации имеют огромное значение для сохранности препарата без потери его эффективности. Например, препарат Церегин^® (гидролизат мозга животных) (РУП «Белмедпрепараты», Белоруссия) благодаря стабилизации фенолом (3 мг/мл) и высокому содержанию соли сохраняется в течение 3 лет. Однако именно фенолы и высокая концентрация соли препятствуют его внутривенному введению. Другой препарат, Церебролизин^® (ЭВЕР Нейро Фарма ГмбХ, Австрия), также производится на основе гидролизатов мозга животных, но с использованием современных фармацевтических технологий, включая международный стандарт GMP³ и современные методы протеомики. Стандарт обязывает применять не только исходное сырье высокого качества, но и высокоточный протеолиз, стандартизацию белковой фракции, очистку от избытка NaCl и пр. Все эти производственные операции выполняются в щадящих условиях, способствующих сохранности конформаций биологически активных пептидов. В результате препарат сохраняет фармакологическую эффективность в течение всего срока годности (5 лет) без феноловых стабилизаторов, без избытка соли и разрешен для внутривенного введения, в т.ч. детям [66].

Использование фенола/парабенов как стабилизаторов фармпрепаратов может соответствовать более низкому качеству их стандартизации по другим показателям. Например, в пилотное исследование по комплексной оценке качества фармацевтической стандартизации различных экстрактов хондроитина сульфата (ХС) вошли шесть препаратов на экстрактах ХС (табл. 1). Образцы были приобретены в государственных аптеках ГБУЗ «Центр лекарственного обеспечения Департамента здравоохранения г. Москвы». Для каждого экстракта изучено по пять образцов [67]. Оценка качества каждого из препаратов проводилась на основании профилей микроэлементного состава (измеренных атомно-эмиссионной спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой), хроматографического анализа, теста на общий белок. Экстракты ХС существенно отличаются друг от друга по суммарному и индивидуальному содержанию токсических микроэлементов. Установлены корреляции между содержанием в них различных химических элементов и степенью очистки от токсических элементов. Показано, что оценки фармацевтического качества исследованных экстрактов ХС по микроэлементному профилю соответствуют оценкам качества по степени очистки от белков и по молекулярно-весовым характеристикам ХС, установленным в результате хроматографических экспериментов [67].

Отметим, что в исследовании [67] препарат на основе экстракта ХС-2 (концентрат ХС из морской рыбы) был стабилизирован фенолом, а на основе экстракта ХС-5 – метилпарабеном. Для препарата ХС-6 (смесь экстрактов ХС животного происхождения – гликозаминогликан-пептидный комплекс) стабилизаторы не указаны, жидкость внутри ампулы отличается характерным «фенольным» запахом (гидрокситолуол или другие метилфенолы). Проведенные эксперименты показали, что все три препарата отличались более низким качеством стандартизации и по всем остальным показателям. Например, они не входили в кластер экстрактов, наиболее близких друг к другу по элементному составу и отличающихся лучшим качеством стандартизации микроэлементного состава. Анализ элементного состава экстрактов в осях «эссенциальные – токсические элементы» продемонстрировал наивысшее суммарное содержание токсических микроэлементов именно в этих трех препаратах (ХС-6 – 14,87±1,81 мкг/л, ХС-2 – 9,20 мкг/л, ХС-5 – 8,86 мкг/л, остальные препараты – 1,9–5,5 мкг/л). В координатах «эссенциальные – токсические элементы» экстракты ХС-6, ХС-5 и ХС-2, соответствующие более высокому содержанию токсических элементов, образовывали отдельный кластер. По результатам хроматографического анализа наименьшее количественное содержание ХС отмечено в образцах ХС-2, ХС-5 и ХС-6 на фоне наибольшего содержания белковых примесей, особенно в ХС-6. Экстракту ХС-6, в частности, соответствовал единственный пик калиброванной хроматограммы – 187±22 Да (глюкуроновая кислота или глюкозамин), что соответствует крайне низкому содержанию ХС (см. подробности в работе [67]).

Очевидно, что препараты со столь низким качеством очистки, стандартизации и стабилизации фенолом/парабенами категорически нельзя рекомендовать для внутрисуставного введения (при остеоартрите). Внутренняя выстилка капсулы сустава представлена тонким слоем хондроцитов/синовиоцитов, обеспечивающих скользящую поверхность сустава и чрезвычайно чувствительных к химическим воздействиям. Поэтому повышенное содержание неизвестных белковых примесей и токсических микроэлементов будет провоцировать усиление воспаления. Низкое содержание ХС соответствует практически полному отсутствию лечебного эффекта. Стабилизация такого рода препаратов фенолом и его производными (парабены, гидрокситолуолы и др.) крайне негативно скажется на состоянии синовиоцитов (фенол и его производные даже в малых дозах провоцируют дерматиты у пациентов с химической чувствительностью к этим соединениям – см. выше).

В результате проведения экспериментального исследования [67] стало очевидно, что наилучшим качеством стандартизации (по данным микроэлементного профиля, степени очистки от опасных белковых примесей и молекулярно-весовым характеристикам ХС) отличался экстракт ХС-1, полученный из трахеи быка. Для ХС-1 заявлена степень очистки более 99%. Именно он является действующим началом препарата Хондрогард^® (ЗАО «ФармФирма Сотекс», Россия) [67]. Субстанция ХС в этом препарате стабилизирована с использованием стандартных компонентов – бензилового спирта (9 мг) и антиоксиданта метабисульфита натрия (1 мг).

Заметим, что бензиловый спирт используется в качестве стабилизатора многочисленных инъекционных лекарственных средств, включая ингибитор ангиотензинпревращающего фермента Энап^® (КРКА д.д., Ново место, Словения), нестероидный противовоспалительный препарат Кетонал^® (Сандоз д.д., Словения), антиаритмик Кордарон^® (Санофи Винтроп Индустрия, Франция), препараты для лечения заболеваний центральной нервной системы Комплигам B^® (ЗАО «ФармФирма «Сотекс», Россия), Витаксон^® (ООО «ДЕКО», Россия) и др. [68]. Данное вещество относится к 3-му классу токсичности (LD50 для острой токсичности составляет 1200 мг/кг у крыс), т.е. «умеренно опасные» вещества по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» (LD50 в диапазоне 151–5000 мг/кг), быстро метаболизируется в еще менее токсичную бензойную кислоту (LD50 1700–3700 мг/кг), конъюгируется с глицином в печени и выводится как гиппуровая кислота [69].

Перспективно дальнейшее изучение эффектов фенола, парабенов, бензилового спирта с использованием новых методов интеллектуального анализа клинических данных, превосходящих методы так называемой биостатистики по чувствительности и воспроизводимости результатов на различных выборках данных [70].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Инъекционные формы препаратов (для подкожного, внутримышечного, внутривенного введения) используются чуть более 100 лет. За это время несколько раз менялся выбор вспомогательных веществ, применяемых как консерванты. От повсеместного применения NaCl и фенола был осуществлен переход к парабенам, а затем к бензиловому спирту, метабисульфиту натрия и другим более безопасным стабилизаторам. Поэтому при анализе препаратов необходимо обращать пристальное внимание не только на действующее вещество, но и на выбор вспомогательных веществ – консервантов, используемых в инъекционных формах.

В настоящее время стабилизация лекарственных средств фенолом или парабенами является устаревшей фармацевтической технологией. В отдельных странах (например, во Франции) запрещено регистрировать препараты, содержащие определенные парабены. Результаты представленного анализа показывают, что на фоне неполной изученности хронической токсичности фенола/парабенов в клинике стало очевидно их негативное влияние на обмен эстрогенов и андрогенов (условно, проэстрогенное и антиандрогенное действие), а также стимулирование патофизиологии онкогенеза (систематические нарушения экспрессии генов), тератогенное действие и эмбриотоксичность. В частности, в клинических исследованиях установлены связи между поступлением парабенов в организм беременной и нарушениями метаболизма с последующим долговременным негативным воздействием на здоровье детей (гиперактивность и синдром дефицита внимания, избыточная масса тела, астма, дисфункция щитовидной железы).

С точки зрения клинической практики патогенетический эффект малых доз токсикантов усиливается с возрастом пациента, в т.ч. вследствие частичного снижения функционирования органов детоксикации (печени и почек) и наличия коморбидных заболеваний. Некоторые лекарственные средства применяются длительно. Например, рекомендованный курс инъекций препаратов на основе ХС при остеоартрите различного генеза составляет 25–30 инъекций с режимом дозирования внутримышечно через день, причем для поддержки ремиссии он может повторяться 2–3 раза в год. Если используемые препараты, содержащие ХС или, предположительно, влияющие на его биосинтез, содержат фенол или парабены (пусть и в малых количествах), то такое «лечение» существенно повышает токсическую нагрузку на различные органы и системы организма. Квазиэстрогенное и антиандрогенное действие фенолов/парабенов даже в малых дозах приводит к повышению онкориска. При попытках внутрисуставного введения такого рода препаратов они будут оказывать прямой раздражающий эффект на ткани сустава.

Отметим также, что отсутствие указания на токсическое действие парабенов и фенолов в отдельных клинических исследованиях может быть всего лишь артефактом неграмотно проведенного анализа данных. Процедуры статистической обработки результатов, используемые в подавляющем большинстве публикаций, основаны на подходах, разработанных более 100 лет назад. Современные методы анализа больших данных, в т.ч. с привлечением математически обоснованных технологий искусственного интеллекта на основе топологической теории распознавания, позволяют выявлять статистически достоверные и прогностически ценные закономерности, игнорируемые большинством методов так называемой биостатистики. Применение новых решений, основанных на интеллектуальном анализе клинических данных, при изучении проблемы выявления эффектов фенола/парабенов является перспективным направлением дальнейших исследований.