Хемореактомный анализ антиоксидантных свойств производных витамина В12

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Широкий круг биологических ролей витамина В12 обусловлен, прежде всего, специфичными взаимодействиями с белками протеома [1]. Кроме того, корриновое ядро витамеров В12 является удобным «таргетом» для направленного органического синтеза молекул с желаемыми свойствами, в т.ч. для таргетной доставки лекарств, использования в качестве антидотов, разработки химических сенсоров, молекул с антиоксидантными, нейропротекторными и хелатирующими свойствами [2–10].

Известны многие модификации витамина В12. В частности, четыре его формы – цианокобаламин (CNCbl), гидроксикобаламин (OHCbl), 5’-дезоксиаденозилкобаламин (AdoCbl) и метилкобаламин (MeCbl) разрешены для использования в составе витаминно-минеральных комплексов (ВМК). Они имеют разную биодоступность, стабильность и эффективность при использовании в виде различных лекарственных форм. Лекарства с витамином В12, ВМК и «фортифицированные» продукты питания чаще всего содержат CNCbl из-за его лучшей стабильности по сравнению с другими тремя формами витамина B12 [11].

Биодоступность витамина В12 зависит от молекулярного окружения, в котором молекулы В12 поступают в организм. Общеизвестно, что витамин В12 максимально концентрируется в печени и продуктах из печени. Высокие концентрации витамина В12 отмечаются в мясе, рыбе, а также в цельном молоке, яйцах. Растительные продукты, как правило, содержат малые количества витамина В12 и фолатов, за исключением водорослей нори (так называемые пурпурные водоросли, Neopyro piayezoensis): содержание в них витамина В12 достигает 30–60 мкг на 100 г сухого веса, активных фолатов (5-метилтетрагидрофолат) – 880–1300 мкг на 100 г [12]. Сообщается, что источником фармацевтических субстанций витамина В12 являются особые штаммы дрожжей S. cerevisiae, продуцирующие В12 [13]. У людей с нормальным состоянием желудка биодоступность витамина В12 составляет 42% из мяса рыбы, 89% – из нежирной баранины, 66% – из куриного мяса, 9% – из яиц. В норме биодоступность витамина В12 регулируется системой кишечной абсорбции. При поступлении продуктов, содержащих витамин В12, в течение одного приема пищи всасывается около 1,5–2,0 мкг [14].

Молекулярное окружение витамина В12 может изменять стабильность корринового кольца. Например, антиоксидант аскорбиновая кислота используется для повышения стабильности различных форм витамина В12 [15]. Несмотря на то что аскорбиновая кислота может использоваться в фармацевтике для стабилизации В12, цианокобаламин и его производные и сами проявляют антиоксидантные свойства. Анализ влияния на антиоксидантный статус и на микронутриентный обмен – важный этап в оценке безопасности потенциальных лекарств.

В модели глобальной ишемии/реперфузии мозга у крыс (перевязка сонных артерий на 20 мин) цианокобаламин в дозах 200 и 400 мкг/кг улучшал показатели памяти за счет ингибирования некроза и апоптоза гибели клеток гиппокампа. При этом было показано, что витамин В12 проявлял статистически достоверное антиоксидантное действие: при приеме CNCbl отмечены повышение уровней глутатиона (р<0,01) и супероксиддисмутазы (р<0,05), снижение уровней малонового диальдегида (р<0,05) и провоспалительного фактора некроза опухоли альфа (р<0,05). Параллельно CNCbl существенно ограничивал формирование нарушений пространственной памяти (р<0,05), снижая апоптоз и некроз нейронов в зоне СА1 гиппокампа (р<0,01) [16].

Цианокобаламин показал защитное антиоксидантное действие в модели поражения метотрексатом почек у крыс, сопровождающейся значительным повышением уровней мочевины и креатинина (р<0,05). Дотации CNCbl (0,5, 1, 1,5 мг/кг/сут в течение 2 нед внутрибрюшинно) повышали уровень антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы и снижали концентрации прооксидантного малонового диальдегида в крови и почках, также способствуя уменьшению уровней мочевины и креатинина в крови в сторону диапазона нормы (р<0,05) [15].

Важно отметить, что антиоксидантные свойства витамина В12 могут быть связаны как со специфическими взаимодействиями с белками протеома (например, активация белков-антиоксидантов), так и с прямым действием молекул на активные формы кислорода. Оценка интегральных антиоксидантных свойств молекул основана на измерении показателей рН-зависимых реакций переноса электрона: ROO• + [молекула] → ROO– + [молекула]•, [молекула]H• + H₂O ↔ [молекула]• + H₃O+, ROO– + H₃O+ ↔ ROOH + H₂O и др. [17].

Самым распространенным подходом к оценке антиоксидантных свойств молекул или природных экстрактов является метод тролоксовых эквивалентов (англ. trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC), осуществляемый с использованием оксидантов 2,2'-азино-бис-этилбензтиазолино-6-сульфоната [18], азосоединения 2-гидрокси-5-арилалкилфенон или 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) [19]. Также применяются тест-системы на основе меди (медь-восстанавливающая антиоксидантная емкость – англ. сupric reducing antioxidant capacity, CUPRAC) [20] с использованием оценки перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, методы переноса атома водорода с антиоксиданта на субстрат (англ. оxygen radical absorbance capacity, ORAC), а также переноса водорода (англ. total radical-trapping antioxidant parameter, TRAP) и др. [18]. В большинстве вышеперечисленных способов молекулы антиоксиданта вступают в реакцию с флуоресцентной меткой, что приводит к изменениям оптической плотности при заданной длине волны пропорционально концентрации соответствующих активных форм кислорода.

Таким образом, антиоксидантная активность индивидуальных соединений может экспериментально измеряться посредством большого числа методов in vitro и in vivo [21][22]. Перед проведением экспериментальных исследований целесообразно выполнить сканирование молекул-кандидатов in silico, т.е. оценочное моделирование их свойств. Представленная в работе [2] систематизация информации о таргетной модуляции свойств корринов посредством химических модификаций указала на выборку молекул – кандидатов для исследований корринов in silico, in vitro и in vivo (аквакобаламин, аквациано-формы гептаэтаноламин-, гептаэтилендиамин-, гептаметил- и гептабутилкобиринатов).

Ранее нами было показано, что тетрапиррольные макрогетероциклические соединения, к которым относится витамин В12 и его производные, могут образовывать наноструктуры [23][24], а также стабильные наночастицы [25] с улучшенными свойствами, что делает их актуальной группой веществ для изучения в качестве перспективных наноформ лекарственных препаратов. Получены уникальные наночастицы производного витамина В12 – гептабутилового эфира цианоаквакобириновой кислоты с особыми свойствами и активностью [26]. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что второе изучаемое в настоящей работе производное витамина В12 (гептаметиловый эфир цианоаквакобириновой кислоты) проявляет биоактивность [27]. Важно отметить, что, поскольку это соединение при загрузке его в белковый наноноситель собирается в наночастицы, оно in vivo демонстрирует такую же эффективность, как и без белкового наноносителя, в отличие от витамина В12 и аквакобаламина, эффективность которых при этом снижается. Антиоксидантные свойства и влияние на обмен витаминов и микроэлементов для производных витамина В12 до настоящего времени не были исследованы.

Цель – хемореактомная оценка антиоксидантных эффектов витамина В12 и его производных: аквакобаламин, диаквакобинамид, аквациано-формы гептаэтаноламин-, гептаэтилендиамин-, гептаметил- и гептабутилкобиринатов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Исследуемые соединения / Studied compounds

В работе представлены результаты сравнительного хемопротеомного анализа витамина В12 и его производных: аквакобаламина, диаквакобинамида (DACbi), аквациано-форм гептаэтаноламин-, гептаэтилендиамин-, гептаметил- и гептабутилкобиринатов (AC^EACby, AC^EDCby, AC^MeCby и AC^BuCby соответственно).

Хемореактомный и фармакоинформационный анализ / Chemoreactomic and pharmacoinformatic analysis

Сравнение соединений проводилось методом хемореактомного анализа, основанного на теории изоморфизма размеченных графов и современных методах прогнозирования числовых таргетных переменных [28].

Для осуществления хемоинформационного хемореактомного анализа разработана специальная проблемно-ориентированная теория в границах комбинаторной теории разрешимости [29–31] – современный математический инструментарий для анализа качества порождаемых признаковых описаний различных объектов [32], в т.ч. молекул, представленных в виде хемографов. Хемограф (χ-граф) – особая разновидность графа, т.е. математического объекта, являющегося совокупностью множества вершин и множества ребер – связей между вершинами. Хемографом называется конечный, связный, неориентированный и размеченный граф без петель, с кликовым числом, не превышающим 3 [33]. В соответствии с постулатами специальной комбинаторной теории разрешимости выписывается условие разрешимости, на основании которого определяется функция расстояния между χ-графами dχ. Формула расстояния позволяет вычислять так называемые химические расстояния между парами сравниваемых молекул.

Первым шагом хемореактомного анализа является установление списка молекул, наиболее близких по структуре к оцениваемой молекуле (т.е. вычисление dχ). Второй шаг – извлечение из баз данных экспериментальной информации о молекулах, схожих с заданной. На этом шаге из базы данных PubChem выбирали данные об антиоксидантных активностях, измеренных для различных молекул посредством тест-систем на основе тролоксовых эквивалентов, ДФПГ, CUPRAC, ORAC, TRAP и др. [18]. При проведении фармакоинформационного анализа из PubChem извлекали информацию о негативных взаимодействиях различных молекул с теми или иными микронутриентами. Третий шаг – оценка биологических активностей исследуемой молекулы (в т.ч. моделирование взаимодействия с протеомом), т.е. собственно хемореактомный анализ.

Представленные в проведенных исследованиях оценки значений биологических констант получены как математическое ожидание и дисперсия соответствующих эмпирических функций распределений.

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Хемореактомный анализ антиоксидантных эффектов молекул / Chemoreactomic analysis of molecules’ antioxidant effects

В рамках хемореактомного моделирования антиоксидантных эффектов производных витамина В12 (профилирования) проведена оценка антиоксидантных свойств, которые экспериментально измеряются посредством различных биохимических технологий (ДФПГ-спектрофотометрия, тролоксовые эквиваленты и др.). Всего получены оценки 140 антиоксидантных активностей для шести молекул. Из сравнения профилей активностей очевидно, что результаты для аквакобаламина заметно отличаются от всех других молекул (табл. 1).

На метрической диаграмме (рис. 1) каждому соединению соответствует та или иная точка, которой, в свою очередь, соответствует 140-мерный вектор, отражающий весь комплекс оцененных антиоксидантных свойств взаимодействий с протеомом. Очевидно существование двух кластеров молекул с близкими протеомными свойствами: аквакобаламин и кластер из трех кобириновых соединений и двух гидрофобных производных.

Хемореактомное моделирование антиоксидантных свойств производных витамина В12 в тест-системах, основанных на оксиданте ДФПГ, при различном времени воздействия молекул (15–60 мин) в различных концентрациях (молярные концентрации 10–125 мкМ, 50–3000 мкг/мл) показало, что аквакобаламин проявляет наиболее выраженные антиоксидантные свойства (рис. 2а), причем при более низких молярных концентрациях (до 100 мкМ) (рис. 2b), а при более высоких концентрациях (125 мкМ) антиоксидантная активность других производных витамина В12 была выше.

При дозозависимом анализе антиоксидантных эффектов с оценкой концентраций очень высокие концентрации (3000 мкг/мл) парадоксальным образом приводили к ингибированию антиоксидантных свойств всех молекул. Хемореактомный анализ антиоксидантного действия с использованием тролоксовых эквивалентов показал схожие результаты: нарастание антиоксидантных эффектов соединений, измеренных в тролоксовых эквивалентах, при возрастании концентраций от 5 до 100 мкМ. При этом аквакобаламин отличался более выраженными антиоксидантными свойствами (рис. 2с).

В таблице 2 приведены результаты хемореактомного моделирования антиоксидантных активностей, которые определяются посредством самых разнобразных биохимических технологий, в т.ч. измерения перекисного окисления липидов с использованием различных оксидантов (CuSO₄, FeCl₃, ДФПГ, активные формы кислорода: OH-радикалы, H₂O₂, супероксид-анион), различных физических методов (ультрафиолетовая спектрофотомерия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, нитритный метод, иммунохимия ELISA) в различных тест-системах (тролоксовые эквиваленты, тиобарбитуровая кислота, разложение 2-дезокси-D-рибозы) и в различных биосубстратах (в плазме крови, микросомах, просто in vitro).

Несмотря на существенные различия в подходах к определению антиоксидантных свойств, перечисленных в таблице 2, данные результаты подтверждают более выраженные антиоксидантные свойства аквакобаламина: значения процентов антиоксидантной активности (ингибирования оксидации) для аквакобаламина были, как правило, выше, а значения констант концентрации полумаксимального ингибирования (англ. half-maximal inhibitory concentration, IC50) – ниже по сравнению с другими молекулами. Напомним, что более низкие значения константы IC50 соответствуют более высокой активности вещества, ведь его требуется меньше для достижения того же эффекта – ингибирования оксидативного стресса на 50%.

Фармакоинформационный анализ антимикронутриентных свойств молекул / Pharmacoinformatic analysis of molecules’ antimicronutrient effects

При изучении молекул потенциальных лекарств важно оценить их побочные эффекты, в т.ч. возможное стимулирование интенсивных потерь тех или иных витаминов и микроэлементов (минералов). Анализ соответствующих компонент фармакоинформационных профилей исследуемых соединений указал на существенные различия в антимикронутриентном действии рассмотренных молекул.

Следует отметить, что все исследованные соединения отличались умеренным антимикронутриентным действием (суммарный балл около 3,0; для большинства синтетических лекарств значение этого балла выше 3,6). Наименее выраженным антимикронутриентным действием характеризовался аквакобаламин (суммарный балл менее 0,8, что указывает на практически полное отсутствие антивитаминного и антиминерального действия). Остальные молекулы умеренно влияли на гомеостаз витаминов (за исключением тиамина и витамина D) (рис. 3а) и минералов (за исключением магния и кальция) (рис. 3b).

Высокие значения полученных оценок (0,5 и более) для магния, кальция, витамина В1 и витамина D указывают на то, что исследованные молекулы (кроме аквакобаламина) могут стимулировать выведение и/или снижение всасывания этих микронутриентов. Аквакобаламин характеризовался наименьшим антиминеральным действием: суммарный балл 0,78 (0,33 – антивитаминное действие, 0,45 – антиминеральное) (рис. 3с), что соответствует в среднем увеличению риска выведения того или иного микронутриента не более чем на 5%.

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

Полученные в настоящем исследовании результаты не имеют мировых аналогов, т.к. в литературе неизвестны примеры исследования свойств всех обсуждаемых соединений с использованием хотя бы одной из тест-систем (тролоксовых эквивалентов и др.). Перспективы полученных данных для клинической практики и направления будущих исследований очевидны – аквакобаламин является, по всей видимости, наиболее выраженным антиоксидантом из исследованных молекул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Синтетические производные витамина В12 проявляют различные физические, химические и фармакологические свойства. Разработка методов прогнозирования свойств этих молекул по их химической структуре важна для направленного органического синтеза корринов. Ранее нами были установлены противоопухолевые и противовоспалительные эффекты производных витамина В12 (аквакобаламин, диаквакобинамид, аквациано-формы гептаэтаноламин-, гептаэтилендиамин-, гептаметил- и гептабутилкобиринатов). Результаты настоящего исследования показывают, что все изученные соединения в той или иной степени проявляют антиоксидантные свойства и умеренно влияют на обмен других микронутриентов. Эти свойства производных витамина В12 могут усиливать их противоопухолевое действие.