Исследование пролиферативных свойств карбоната и аскорбата лития на модели метастазирования перевиваемой карциномы легких Льюис

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Литий – важнейший ультрамикроэлемент, необходимый для нормального функционирования всех систем организма, в т.ч. для обмена белков, жиров, углеводов. Хорошо исследованы свойства солей лития как нейропротекторов и нейротрофических факторов [1], начинает изучаться противораковое действие органических солей лития [2].

Среди различных солей лития наиболее широко используется карбонат. Практическое применение данного соединения в клинической практике (терапия биполярного расстройства и маний) указало на его заметную нефротоксичность, особенно при приеме в течение длительного времени (месяцы) в высоких дозах (граммы). Для эффективного и безопасного использования препаратов карбоната лития необходимо регулярно измерять концентрацию лития в крови, что является дополнительной инвазивной процедурой [3].

Токсичность карбоната лития стимулирует поиск новых солей для использования в терапии литием. Одним из таких перспективных вариантов является аскорбат лития [4]. Отметим, что аскорбиновая кислота сама по себе проявляет противоопухолевое действие [5]. Дефицит витамина С приводит к усилению инвазии опухолевых клеток [6]. Витамин С характеризуется выраженной противоопухолевой активностью как сам по себе, так и в комбинации с химиотерапией (доксорубицин и др.) [7], имеет противовоспалительное действие, снижая уровни провоспалительных интерлейкинов 1, 2, 6 и фактора некроза опухоли альфа при различных видах рака (простаты, молочной железы и др.) [8]. Внутривенное введение витамина С на протяжении многих десятилетий используется в качестве адъювантной терапии для пациентов со злокачественными новообразованиями [9]. Таким образом, аскорбат лития является интересным объектом для исследования его противоопухолевых свойств.

Цель – изучение противоопухолевых эффектов органической соли лития (аскорбат лития, LiAsc) в различных дозах в сравнении с неорганической солью (карбонат лития, Li₂CO₃).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Серии экспериментов / Experimental series

У аутбредных самцов мышей линии F1 (CBA × C₅₇Bl/6j) (n=90, возраст 2,5–3 мес, масса тела 23–26 г) с перевиваемой карциномой легких Льюис (КЛЛ) проведены две серии экспериментов:

• сравнение эффектов LiAsc в различных дозах (1 и 10 мг/кг/сут);
• сравнение эффектов LiAsc и Li₂CO₃в дозе 5 мг/кг/сут.

Подсадку КЛЛ проводили введением 2×10⁶ кл/0,1 мл суспензии в поверхность правого бедра после депиляции.

Было сформировано пять групп животных:

• LiAsc в дозе 1 мг/кг/сут (n=20);
• LiAsc в дозе 10 мг/кг/сут (n=20);
• LiAsc в дозе 5 мг/кг/сут (n=20);
• Li₂CO₃в дозе 5 мг/кг/сут (n=20);
• контрольная группа (n=10).

Продолжительность наблюдений составила 3 нед. После подсадки КЛЛ с 7-х по 20-е сутки проводилось ежедневное зондирование LiAsc или Li₂CO₃ в указанных дозах с использованием 1% крахмального геля ex temp. Взвешивание животных и измерение размеров опухолевых узлов выполняли на 3-е, 7-е, 10-е, 13-е, 17-е и 21-е сутки от начала эксперимента.

Этические аспекты / Ethical aspects

Животные питомника ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» cодержались в условиях естественного освещения при температуре 18–20 °C, влажности воздуха 40–70%, с брикетированным кормом и питьем ad libitum в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.), и общепринятыми этическими нормами. На 21-е сутки животных выводили из опыта путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом, выделяли легкие, фиксировали их 24 ч в жидкости Буэна и далее выполняли подсчет числа крупных и мелких легочных метастазов.

Оценка эффектов / Evaluation of effects

Эффекты применения солей лития оценивали посредством наблюдения за неврологическим статусом и поведением животных, измерения массы тела и количественных оценок динамики роста опухоли и метастазирования.

Объем КЛЛ определяли по формуле:

V = (L × W2) × (π/6),

где L – максимальный диаметр; W – диаметр, ортогональный к L.

Индекс торможения роста опухоли (ТРО) вычисляли по формуле [11]:

ТРО = 100% × (V_к – V_о) / V_к ,

где V_к и V_о – средние объемы узлов в группах контроля и опыта соответственно.

Количественные оценки динамики роста опухоли и метастазирования проводили посредством измерения параметров V и ТРО на 3-е, 7-е, 10-е, 13-е, 17-е и 21-е сутки. Метастазы относили к крупным или малым на основании экспертного анализа гистотопограмм срезов легких и печени, окрашенных по схеме «гематоксилин + эозин». Крупными считались метастазы размером более 200 мкм.

Статистический анализ / Statistical analysis

Для изученных параметров (масса тела, объем опухолевого узла, ТРО и т.д.) проводили подсчет среднего и стандартного отклонения (M±SD). Оценку статистической достоверности осуществляли по критериям Краскела–Уоллиса и Данна в программе Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США). Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. Тест на нормальность распределения выполняли с помощью визуального анализа наблюдаемых и ожидаемых гистограмм распределения данных с подтверждением тестом χ² нулевой гипотезы об отсутствии отличий между наблюдаемым распределением и ожидаемым нормальным распределением (р>0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

При выполнении двух серий экспериментов противоопухолевые эффекты установлены для более низких доз LiAsc (1 и 5 мг/кг/сут).

Эффекты аскорбата лития в дозах 1 и 10 мг/кг/сут // Effects of lithium ascorbate at doses of 1 and 10 mg/kg/day

Прием LiAsc в указанных дозах не вызывал неврологических или каких-либо поведенческих нарушений, включая прием пищи. Не установлено статистически значимых отличий в динамике роста массы тела (табл. 1).

Через 7 сут после начала эксперимента опухолевый узел определялся у всех животных. Гибель единичных подопытных отмечена только к 21-м суткам после воспроизведения модели КЛЛ. Исключение составляло одно животное в группе, получавшей LiAsc в дозе 10 мг/кг/сут, у которого до конца эксперимента не определялся первичный опухолевый узел КЛЛ и полностью отсутствовали легочные метастазы. Это наблюдение мы склонны расценивать как неудавшуюся трансплантацию карциномы, и при анализе данные по этому животному были исключены из рассмотрения.

В низкой дозе (1 мг/кг/сут) LiAsc стимулировал умеренное и стабильное ингибирование роста КЛЛ – на 20–30% (табл. 2), хотя этот эффект и ослабевал на поздних сроках наблюдения. При использовании высокой дозы LiAsc (10 мг/кг/сут) не наблюдалось сколько-нибудь значимого влияния на опухолевый рост.

Различалось воздействие LiAsc в использованных дозах и на метастатический прогресс карциномы (табл. 3). Если в низкой дозе (1 мг/кг/сут) изучаемое соединение не оказывало какого-либо влияния на метастазирование КЛЛ, то при высокой дозе (10 мг/кг/сут) наблюдались статистически достоверное усиление процессов метастазирования и стимуляция роста легочных метастазов КЛЛ.

Результаты экспериментов с аскорбатом и карбонатом лития в дозах 5 мг/кг/сут // Results of experiments with lithium ascorbate and carbonate at doses of 5 mg/kg/day

Субхроническое внутрижелудочное введение LiAsc и Li₂CO₃ (5 мг/кг/сут) не приводило к неврологическим нарушениям, изменениям пищевой активности или различиям в динамике массы тела (табл. 4).

Анализ динамики роста опухолевого узла КЛЛ показал, что LiAsc и Li₂CO₃ уже через 3 сут после начала применения вызывали умеренное торможение роста опухолей – на 10–15% (табл. 5).

Значительную помеху для детального анализа этого эффекта в данном опыте представлял высокий исходный (на 7-е сутки) межгрупповой разброс. Поэтому для более четкого выделения эффектов изучаемых препаратов на рост КЛЛ исходные данные были нормированы на начальные величины объема опухоли на 7-е сутки. Статистический анализ таким образом преобразованных данных подтвердил, что оба препарата лития в этом опыте оказывали противоопухолевое действие на КЛЛ (табл. 6, рис. 1).

Сравнение эффектов LiAsc и Li₂CO₃ показало, что действие LiAsc более заметно (наличие статистически достоверного эффекта с 10-х суток наблюдений при значении индекса ТРО 30–40%), чем действие Li₂CO₃ (ТРО 20–30%). LiAsc и Li₂CO₃ практически не влияли на формирование метастазов (табл. 7).

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

Соли лития считаются важными молекулами – кандидатами для противоопухолевой терапии. Воздействие ионов Li+ на сигнальные маршруты, вовлеченные в механизмы деления и пролиферации клеток (PKB/Akt, Wnt/catenin, Е-циклин и др.), предоставляет фундаментальную базу, обосновывающую возможность применения литиевых препаратов как противоопухолевых средств [12][13].

В литературе имеются исследования эффектов солей лития на гепатоцеллюлярную карциному [13], рак головы и шеи [14], рак толстой кишки [15][16] и т.д. В частности, неорганический хлорид лития индуцирует мезенхимально-эпителиальный ревертирующий переход в первичных культурах клеток рака толстой кишки. Однако, за редким исключением (например, исследование эффектов соли лития на раковую кахексию [17]), подавляющее большинство таких исследований были проведены in vitro на культурах опухолевых клеток и не были апробированы на животных.

По имеющимся данным отечественной и мировой научной литературы, к настоящему времени нет исследований, в которых бы изучались противоопухолевые эффекты солей лития на модели КЛЛ (которая является, подчеркнем, стандартной моделью для исследования противоопухолевых свойств соединений). В этом смысле в настоящей работе получены уникальные результаты, вносящие существенный вклад в оценку противоопухолевого действия солей лития.

Возможно, отсутствие воспроизводимых и надежных результатов по противоопухолевым эффектам солей лития у животных связано с тем, что практически все исследования такого рода используют только неорганические соли лития (карбонат, хлорид). Между тем неорганические соли лития вообще и карбонат лития в частности характеризуются сниженным всасыванием внутрь клеток (в отличие от солей с органическими анионами, для которых имеются соответствующие транспортные каналы [4]). В настоящем исследовании показано, что противоопухолевые свойства аскорбата лития более выраженны, чем в случае карбоната лития при использовании в том же количестве (в расчете на элементный литий).

Помимо собственно противоопухолевого действия нейропротекторные эффекты таких органических солей лития, как аскорбат [1][4], весьма важны для защиты нервной системы пациентов, проходящих химиотерапию веществами с выраженным нейротоксичным побочным действием. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейших доклинических исследований аскорбата лития на других моделях опухолей и использования солей лития в качестве адъювантной терапии у пациентов с онкологическими заболеваниями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

При зондировании мышей с моделью КЛЛ LiAsc в дозах 1 и 5 мг/кг/сут проявляет устойчивую тенденцию к торможению роста КЛЛ при отсутствии антиметастатического действия. При субхроническом введении LiAsc животным-опухоленосителям в ежедневной дозе 10 мг/кг не отмечено торможения роста КЛЛ. При субхроническом введении LiAsc и Li₂CO₃ животным в ежедневной дозе 5 мг/кг регистрируется противоопухолевый эффект, проявляющийся торможением роста КЛЛ.

Наиболее выраженное и стабильное действие оказывает LiAsc: при его субхроническом воздействии индекс ТРО составляет 30–40%. Антиметастатического эффекта обоих препаратов в дозе 5 мг/кг/сут не наблюдается.