Бактериоцины представляют собой антибактериальные пептиды, состоящие из 15–20 аминокислот. Они действуют как антибиотики против грамположительных бактерий (например, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) и, в меньшей степени, против грамотрицательных (в частности, E. coli). Торможение развития бактериального компонента инфекции является важным шагом в лечении и профилактике тяжелого течения смешанных вирусно-бактериальных инфекций [1]. Например, течение острых респираторных заболеваний (ОРЗ) может существенно усложняться бактериями Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Fusobacterium necrophorum [2][3]. Бактериоцины используются в лекарственных средствах для терапии назофарингита, тонзилита, ринита, ангины, ларингита и в препаратах местного действия для лечения инфицированных ран [4][5].

Аминокислотная последовательность «линейных» бактериоцинов А и В (формил-X-Gly-Ala-D-Leu-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu-Trp-D-Leu-Trp-этаноламин, X = триптофан в бактериоцине A, X = фенилаланин в бактериоцине B) сформированы так, что образуют спиральные фрагменты структуры белка (рис. 1). «Линейные» бактериоцины являются ионофорами: их спиральные димеры образуют поры в клеточных мембранах и в органеллах бактерий, что нарушает натрий-калиевый баланс бактерий и приводит к гибели клеток [6]. Этот механизм действия бактериоцинов обусловливает отсутствие резистентности, характерной для многих других антибиотиков.

Бактериоцин C (известный также как грамицидин) — «циклический» вариант бактериоцина, в котором «линейная» последовательность аминокислот замкнута в цикл. Он характеризуется бактериостатическим и бактерицидным действием в отношении стрептококков и стафилококков, грамположительных анаэробных бактерий и др. В частности, бактериоцин С оказывает бактериостатическое действие на Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus spp. [7]. Он применяется наружно в терапии гнойных и воспалительных инфекций кожи и мягких тканей, язв, пролежней, при воспалительных заболеваниях уха и горла, стоматите, гингивите, конъюнктивите, кератите, блефарите, фурункулезе.

Заметим, что имеется ряд мисконцепций, связанных со свойствами бактериоцина С. Пропоненты данных мисконцепий действуют агрессивно, не располагая никакими научными данными, подтверждающими их заявления. Например, считается, что грамицидин С «полностью инактивируется в кислой среде желудка», поэтому якобы «не воздействует на бактерии кишечника». Подобного рода утверждения противоречат общеизвестному факту: среда в кишечнике нейтральная или слабощелочная (рН>7,0 в тонком кишечнике, рН>8,0 в толстом кишечнике). Имеются также не вполне корректные и бездоказательные утверждения о том, что якобы грамицидин С «аналогичен бактериоцинам комменсалов ротоглотки». Такие заявления полностью игнорируют и существенные различия в размерах белков (на порядок и более), и, конечно же, свойства белков. Также распространяются ничем не обоснованные заблуждения о якобы низкой всасываемости и системной биодоступности данной молекулы и делаются далеко идущие выводы о том, что, мол, распределение и накопление в тканях не имеет принципиального значения. Такого рода мисконцепции обусловливают необходимость сравнительных исследований различных бактериоцинов (в частности, по отношению к микробиому человека).

Известны также бактериоцины, которые не являются пептидами. Например, бактериоцин S (также известен как «малый бактериоцин») был исходно выделен из культуральной жидкости грамотрицательной бактерии Rhizobium leguminosarum, образующей симбиотические азотфиксирующие клубеньки на ряде бобовых растений. Бактериоцин S структурно связан с котранскрипционными факторами, влияющими на рост бактерий Vibrio fischeri, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora и др. [8].

Бактериоцин 28b из Serratia marcescens проявляет бактерицидную активность против грамотрицательных бактерий (прежде всего, E. coli). Анализ мутантных штаммов E. coli показал, что воздействие бактериоцина 28b осуществляется при участии основного липополисахарида, белков наружной мембраны OmpA и OmpF, а также бактериальных белков TolQ, TolA и TolB [9]. Синтетический бактериоцин RS-2020 – перспективная молекула для исследования антибактериальных свойств.

В целом сравнительное изучение эффективности и безопасности бактериоцинов представляет существенный научный и практический интерес. Перед проведением масштабных экспериментальных исследований in vivo или клинических испытаний целесообразно оценить различия в эффективности бактериоцинов на более фундаментальном уровне. Хемомикробиомные скрининги препаратов, проводимые на основе современных информационных технологий анализа больших данных, позволяют оценивать эффекты веществ на различные типы бактерий-комменсалов в желудочно-кишечном тракте человека и на различные штаммы болезнетворных бактерий [10–12].

В настоящей работе представлены результаты сравнительного хемомикробиомного анализа бактериоцинов С, A и B, S, 28b и RS-2020. Хемомикробиомный анализ основан на хемоинформационном подходе, теории анализа размеченных графов, теории метрического анализа данных [13], комбинаторной теории разрешимости, топологической теории анализа [14] плохо формализованных задач и новейших методов прогнозирования значений числовых переменных [15].

Цель – комплексный анализ спектра антибактериального действия бактериоцинов.

Проведен хемомикробиомный анализ молекул бактериоцинов (рис. 2). Хемореактомный подход к анализу фундаментальной проблемы «структура – свойство» молекул – один из новейших трендов применения систем искусственного интеллекта в постгеномной фармакологии. При этом анализ фармакологического «потенциала» исследуемых молекул выполняли в рамках хемоинформационной парадигмы, т.е. путем сопоставления химической структуры изучаемой молекулы со структурами миллионов других молекул, фармакологические свойства которых были ранее изучены в экспериментальных и клинических исследованиях.

«Обучение» алгоритмов искусственного интеллекта осуществляли на основе больших данных, собранных в таких ресурсах, как PubChem/PHARMGKB, HMDB, STRING [16–18] и др., и реализовали с использованием многоуровневого контроля качества обучения в рамках топологического подхода к распознаванию информативных паттернов в данных [13–15].

Теория топологического распознавания – это развитие алгебраического подхода к проблемам распознавания. Она является полезным инструментом изучения описаний характеристик (признаков) объектов. В случае хемореактомного анализа объектами исследования являются хемогрáфы (χ-графы) – особые типы графов, т.е. математических конструкций, каждая из которых состоит из группы вершин и группы ребер – связей между вершинами. В рамках теории топологического распознавания вводится функция расстояния dχ, отражающая химическое расстояние между двумя произвольными молекулами [10–12].

Для обработки собранных данных применяли новейшие методы топологической теории машинного обучения [15]. На первом этапе, используя способ вычисления химического расстояния dχ, устанавливали список молекул, наиболее близких к исследуемому веществу. На втором этапе для каждой молекулы из базы данных извлекали все измеренные фармакологические свойства. Затем для каждого из фармакологических свойств строили эмпирическую функцию распределения (ЭФР) значений этого свойства. Значения различных фармакологических свойств вычисляли как математическое ожидание и дисперсию соответствующих ЭФР [10].

Для каждого из изученных веществ были получены значения площади под кривой роста (англ. area under growth curve, AUC) для репрезентативной выборки нормобиоты человека, включившей 38 бактерий-комменсалов (в т.ч. различные виды бифидо- и лактобактерий) и более 152 болезнетворных бактерий, которые более подробно описаны в работах [10][12][19]. Данная выборка микробиома включает 21 род бактерий и представляет 78% микробиома желудочно-кишечного тракта.

Большинство исследованных штаммов были комменсалами с относительной численностью 1% или более и распространенностью не менее 50% у здоровых добровольцев. На этой выборке штаммов микробиома для всех молекул на рисунке 1 были оценены значения AUC, их стандартные отклонения и значения статистической достоверности отличий AUC от контроля (стандартная среда выращивания бактерий).

На основании информации в базах данных Human Microbiome Project [17], iHMP [17] и PubChem [18] были разработаны алгоритмы для оценки значений минимальных ингибирующих концентраций (англ. minimum inhibitory concentration, MIC) для 152 штаммов болезнетворных бактерий.

Хемоинформационный анализ позволил оценить воздействие исследованных молекул на протеом (совокупность белков), метаболом (совокупность метаболитов) и микробиом (совокупность микроорганизмов-симбионтов) человека. В частности, в результате проведения анализа были получены:

Хемоинформационный анализ показал, что исследованные молекулы существенно отличались по накоплению в различных тканях организма человека. В частности, бактериоцин С практически не накапливается в тканях мозга и сердца, а концентрируется в желчи и волосах. В фибробластах и ткани селезенки исследованные бактериоцины (за исключением бактериоцина S) накап-ливаются в сопоставимых количествах (рис. 3a). Бактериоцин С может накапливаться в слюне, выводится с мочой и калом, практически не накапливаясь в крови и грудном молоке (рис. 3b).

Проведен анализ схожести химической структуры бактериоцина С со структурами всех молекул в базе данных метаболома человека. Различия между каждой парой молекул оценивалось посредством вычисления химического расстояния dχ (dχ=0 – молекулы идентичны, dχ=1 – молекулы не имеют значимых совпадений структурных фрагментов) [10–12]. Отметим, что степень структурной схожести бактериоцина С и бактериоцинов А/В была невысокой (dχ=0,36, что соответствует совпадению не более чем 64% структурных фрагментов в молекулах бактериоцинов А/В и С).

Среди компонентов метаболома человека наиболее близким к бактериоцину С по химической структуре (значения dχ в диапазоне 0,03–0,20) был ряд нейропептидов, в т.ч. морфицептин (пептид, выделенный из бета-казеина, dχ=0,03), эндоморфин-2 (агонист мю-опиоидных рецепторов, dχ=0,07), нейромедин N (нейропептид, схожий с нейротензином, который стимулирует вазодилатацию и взаимодействует с дофаминергической системой, dχ=0,19). Однако, учитывая крайне низкое накопление бактериоцина С в головном мозге (см. рис. 3а), бактериоцин С вряд ли будет проявлять существенные нейромодулирующие эффекты.

Интересно отметить схожесть структуры бактериоцина С с вазоконстрикторными пептидами вещество Р (dχ=0,38), ангиотензин IV (dχ=0,38), ангиотензин II (dχ=0,43), а также с антигипертензивным препаратом эналаприл (dχ=0,39), принадлежащим к классу ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). Ингибируя АПФ, эналаприл тормозит биотрансформацию ангиотензина I в ангиотензин II, который регулирует артериальное давление и является ключевым компонентом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [20]. Схожесть с эналаприлом позволяет предположить слабый антигипертензивный эффект бактериоцина С при поступлении в системный кровоток.

Выполнено сравнение оценок влияния исследуемых бактериоцинов на 1322 фермента, которые участвуют в формировании метаболома человека, и найдены достоверные отличия для 682 из 1322 метаболических ферментов. В результате сравнений профилей, включающих 682 метаболических фермента, стало возможным построение диаграммы, наглядно характеризующей степень метаболомных различий между исследованными молекулами (рис. 4). Анализ суммированных данных позволяет сделать несколько выводов.

Во-первых, метаболомные эффекты бактериоцина С наиболее близки к метаболомным эффектам бактериоцинов А и В. Все остальные бактериоцины проявляют существенно отличающиеся метаболомные эффекты.

Во-вторых, бактериоцины А/В/С расположены ближе к вертикальной оси, которая отражает степень взаимодействия исследованных бактериоцинов с ферментами биосинтеза АТФ. Эти ферменты вовлечены в биологические процессы энергетического метаболизма клеток (GO:0006754 Биосинтез АТФ, GO:0003873 6-фосфофрукто-2-киназа, GO:0006003 Метаболизм фруктозо-2,6-бифосфата, GO:0009055 Цепь переноса электронов, GO:0006120 Митохондриальный транспорт электронов через никотинамид динуклеотид и убихинон, GO:0006081 Метаболизм альдегидов, GO:0072593 Метаболизм активных форм кислорода, GO:0051591 Ответ на циклический аденозин монофосфат)1.

В-третьих, бактериоцины А/В/С практически не затрагивают горизонтальную ось диаграммы на рисунке 4, которая соответствует взаимодействиям с ферментами катаболизма АТФ и регуляции экспрессии генов. Эти метаболомные эффекты в гораздо большей степени связаны с синтетическим бактериоцином RS-2020 и «малым» бактериоцином S, чем с бактериоцинами А/В/С. Горизонтальная ось соответствует биологическим активностям, связанным с расходованием АТФ (GO:0032869 Клеточный ответ на инсулиновый стимул, GO:0007200 Сигнальный путь рецепторов через фосфолипазу C, GO:0006195 Катаболизм пуринов, GO:0046135 Катаболизм пиримидинов), в т.ч. с использованием АТФ для регуляции экспрессии генов (GO:0006361 Инициация транскрипции РНК-полимеразой I, GO:0010628 Активация экспрессии генов) и для роста клеток (GO:0007411 Рост аксонов, GO:0043005 Рост нейронов, GO:0014069 Постсинаптическая плотность).

В-четвертых, анализ профилей активностей 682 метаболических ферментов дает возможность выделить 15 функциональных категорий по международной номенклатуре GO, отличающих метаболомные эффекты бактериоцина С от бактериоцинов А и В (рис. 5). По сравнению с бактериоцинами А и В для метаболомных эффектов бактериоцина С были более характерны метаболомные эффекты, связанные с аминокислотным метаболизмом (GO:0048038 Связывание хинона, GO:0006541 Метаболизм глутамина, GO:0006536 Метаболизм глутамата, GO:0006103 Метаболизм 2-оксоглутарата), антиоксидантной защитой (GO:0006750 Биосинтез глутатиона), гормональным балансом (GO:0032355 Ответ на эстрадиол, GO:0051384 Ответ на глюкокортикоиды, GO:0042574 Метаболизм ретиналя), липидным метаболизмом (GO:0008610 Биосинтез липидов, GO:0004497 Монооксигеназы, GO:0015721 Транспорт желчных кислот, GO:0030148 Биосинтез сфинголипидов).

В-пятых, воздействие бактериоцина С на метаболом связано с метаболическими ферментами, которые достоверно чаще, чем ферменты из контрольной группы, взаимодействуют с рядом микронутриентных кофакторов: двухвалентными железом Fe(2+) и медью Cu(2+), аскорбат-анионом (витамин С), пиридоксалем (витамин В6) (рис. 6). Соответственно, обеспеченность этими микронутриентами может влиять на метаболизацию и эффективность бактериоцина С.

Таким образом, для бактериоцина С характерен уникальный метаболический отклик организма, отличающий его от эффектов других бактериоцинов. В частности, бактериоцин С практически не взаимодействует с ферментами катаболизма АТФ и регуляции экспрессии генов человека.

В результате хемомикробиомного анализа получены оценки значений AUC для 38 репрезентативных представителей здоровой микробиоты человека (нормобиоты). Для дальнейшего анализа отобраны только те данные, которые соответствовали значениям AUC, статистически достоверно отличающимся от контрольных экспериментов (р<0,05 при сравнении со стандартной средой выращивания бактерий) и со значениями стандартных отклонений AUC, не превышающими погрешность метода (в среднем 0,07 у.е. AUC).

В среднем по выборке здоровой микробиоты значение AUC для бактериоцина С составило 0,62±0,19 у.е. Более высокий усредненный показатель AUC был найден только для бактериоцина 28b (0,72±0,14); для всех остальных бактериоцинов среднее значение AUC было на 15–35% ниже (бактериоцины A/B – 0,54±0,26, бактериоцин RS2020 – 0,44±0,26, бактериоцин S – 0,46±0,28). Полученные результаты суммированы на рисунке 7.

В наибольшей степени пребиотические эффекты бактериоцина С по отношению к нормобиоте были очевидны для бифидобактерий B. longum, участвующих в биосинтезе витаминов и входящих в состав многих пробиотиков (AUC 0,55; для остальных молекул AUC 0,05–0,35). Рост бифидобактерий B. adolescentis, составляющих до 85% нормобиоты и необходимых для всасывания жиров и выработки короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), в наибольшей мере поддерживался бактериоцином С (AUC 0,44) и бактериоцином 28b (AUC 0,57; для остальных молекул AUC 0,04–0,25). Бактериоцин С лучше всех остальных молекул поддерживал рост бактерий Roseburia hominis, которые регулируют Т-лимфоцитарный иммунитет и, кроме того, сами производят антимикробные пептиды (AUC 0,65; для остальных молекул AUC 0,04–0,50).

Для ряда нормобиотических бактерий эффекты бактериоцина С были сопоставимы с эффектами бактериоцина 28b (AUC 0,50–0,88), а эффекты всех остальных молекул были существенно меньше (AUC 0,07–0,60) (рис. 8). К этим бактериям относились:

Очевидно, что, стимулируя микроорганизмы – продуценты масляной кислоты и других КЦЖК, бактериоцин С может проявлять пребиотические свойства.

Хемомикробиомный анализ значений MIC исследованных молекул при воздействии на 152 штамма болезнетворных бактерий показал, что бактериоцин может тормозить рост некоторых болезнетворных организмов. Такие оценки были получены, в частности, для возбудителей кожных патологий (M. audouinii, T. mentagrophytes и др.), инфекций мочевыводящих путей (E. cloacae, протеи P. mirabilis и P. vulgaris), грибов Candida, возбудителей бактериальной пневмонии (H. influenzae, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes), внутрибольничных инфекций (K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae) и для нормофизиологической микробиоты (рис. 9).

Конечно, в ряде случаев говорить о выраженном антибактериальном действии исследованных бактериоцинов на все бактерии не приходится: для отдельных штаммов значения MIC достаточно велики (40–160 мкг/мл). Однако даже такие умеренные эффекты бактериоцинов способствуют элиминации антибиотик-резистентных штаммов рассмотренных микроорганизмов.

Для большинства изученных патогенов бактериоцин С проявлял более выраженные бактерицидные эффекты (или по крайней мере эффекты, сопоставимые с другими бактериоцинами). Например, все исследованные бактериоцины в одинаковой степени ингибируют Fusobacterium necrophorum (возбудитель отита, синусита, назофарингита и др.): средние значения MIC лежали в диапазоне 0,30–0,40 мкг/мл.

В случае возбудителей бактериальной пневмонии Streptococcus pneumoniae (также возбудитель менингита, среднего отита, синусита, эндокардита, септического артрита и др.) средние значения MIC составили 6,25±5,61 мкг/мл для бактериоцина С и 10–13 мкг/мл для всех остальных бактериоцинов. В среднем по различным штаммам Haemophilus influenzae (возбудитель бактериальной пневмонии и других гемофильных инфекций) для бактериоцина С значения MIC составили 10,60±10,48 мкг/мл, для остальных молекул – 11–14 мкг/мл.

Для Klebsiella pneumoniae (вызывает внутрибольничные инфекции, включая пневмонию, сепсис, инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, менингит, абсцессы в печени, особенно при иммунодефицитах) усреднение по 14 штаммам показало сопоставимую активность для бактериоцинов А/В/С (MIC 9,24±7,47 мкг/мл), бактериоцинов RS2020 и S (14,1±13,21 мкг/мл) и несколько лучшую активность для бактериоцина 28b (8,28±14,14 мкг/мл).

В случае 12 штаммов Pseudomonas aeruginosa (вызывает внутрибольничные инфекции, в т.ч. вентилятор-ассоциированную пневмонию и сепсис, характеризуется естественной резистентностью к антибиотикам) эффекты всех бактериоцинов были сопоставимы (MIC 23,34±21,62 мкг/мл).

Для 21 штамма стафилококков S. aureus (вызывает внутрибольничные инфекции, кожные инфекции – прыщи, целлюлит, карбункулы, пневмонию, менингит, эндокардит, бактериемию и сепсис) наименьшие значения MIC были найдены для бактериоцина С (8,75±6,37 мкг/мл, для остальных молекул – 14,59±14,07 мкг/мл).

Анализ значений MIC на выборке нормофизиологической микробиоты (Bacteroides, Enterococcus, непатогенные E. coli) подтвердил описанные выше результаты анализа 38 бактерий – комменсалов нормобиоты. В частности, значения MIC для нормобиоты были достоверно выше для бактериоцина С (28,47±27,16 мкл/мл) и бактериоцинов А/В (24,74±28,39 мкл/мл), чем для остальных молекул (18,48±15,25 мкл/мл). Соответственно, бактериоцины А/В/С в меньшей степени тормозят рост нормобиоты, чем другие бактериоцины.

Был проведен анализ хемомикробиомных алгоритмов, которые характеризовались максимально возможной аккуратностью прогнозирования значений MIC (80–95%). Сопоставление весов признаков в этих алгоритмах с результатами для нормофизиологической микробиоты позволило выявить основные структурные признаки бактериоцина С, связанные с воздействием на патогенную микробиоту. Всего было выявлено более 1000 таких структурных фрагментов. Наибольший вклад в снижение значений MIC для патогенных бактерий вносили пептидные фрагменты между пролином и лейцином (вес –0,13 мкг/мл на один фрагмент в молекуле бактериоцина С), пептидная связь между фенилаланином и лейцином (вес –0,10 мкг/мл), фрагмент боковой цепи лизина (вес –0,107 мкг/мл) и др. (рис. 10).

Лечение ОРЗ может включать топическое применение бактерицидных средств. Представленные в работе оценки значений MIC для 152 штаммов болезнетворных бактерий, полученные посредством хемомикробиомного анализа, показали, что бактериоцин С характеризуется меньшими значениями MIC для различных штаммов H. influenzae, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, F. necrophorum. Важно подчеркнуть, что многие из перечисленных бактерий участвуют в патофизиологии ОРЗ.

Для S. pneumoniae и S. aureus бактериоцин С проявлял более выраженные бактерицидные эффекты по сравнению с остальными бактериоцинами. При усреднении по 10 штаммам S. pneumoniae средние значения MIC составили 6,25±5,61 мкг/мл для бактериоцина С и 10–13 мкг/мл для всех остальных бактериоцинов. Усреднение по 21 штамму стафилококков S. aureus показало наименьшие значения MIC для бактериоцина С (8,75±6,37 мкг/мл, для остальных молекул – 14,59±14,07 мкг/мл). В случае других возбудителей назофарингита бактериоцин С показал эффекты, сопоставимые с остальными бактериоцинами (Haemophilus influenzae: MIC 10–14 мкг/мл, Fusobacterium necrophorum: MIC 0,30–0,40 мкг/мл, Klebsiella pneumoniae: MIC 8–14 мкг/мл, Pseudomonas aeruginosa: MIC 23,34±21,62 мкг/мл).

В то же время бактериоцин С в меньшей степени, чем молекулы сравнения, тормозил рост нормобиоты родов Bacteroides, Enterococcus, непатогенных E. coli, дрожжей S. cerevisiae и др. Более того, основываясь на оценках значений AUC для 38 бактерий – комменсалов человека, можно предположить, что бактериоцин С проявляет пребиотические свойства, стимулируя микроорганизмы – продуценты короткоцепопочечных жирных кислот.

1. Международная номенклатура GO (англ. Gene Ontology).