За последние 10 лет можно отметить определенный прогресс в подходах к лечению злокачественных новообразований. Во многом это обусловлено бурным развитием иммунотерапии. Самым ярким достижением иммунотерапии можно назвать ингибиторы иммунных контрольных точек (иИКТ) или чекпойнт-ингибиторы (англ. checkpoint inhibitors). Впервые одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (англ. U.S. Food and Drug Administration, FDA) в 2014 г., иИКТ сейчас применяются как первая линия терапии во многих солидных и гематологических онкологиях.

Иммунные контрольные точки могут быть стимулирующими или тормозящими. Опухоли зачастую используют их для ускользания от атаки иммунной системы. Современные иИКТ блокируют рецепторы контрольных точек. Блокировка сигналов отрицательной обратной связи к клеткам иммунной системы приводит к усилению противоопухолевого иммунного ответа. Например, моноклональные антитела, блокирующие взаимодействие между трансмембранным белком запрограммированной клеточной смерти 1 (англ. рrogrammed cell death protein 1, PD-1) и его лигандом (англ. рrogrammed death ligand-1, PD-L1), помогают Т-клеткам успешнее атаковать опухоль [1].

Активация адаптивного иммунитета эффективна даже на поздних стадиях заболевания. Однако при этом могут возникать тяжелые побочные эффекты (нейротоксичность, цитокиновый шторм и др.). Кроме того, значительная часть пациентов не отвечает на терапию иИКТ [2]. Для стратификации больных на потенциальных «ответчиков» и «неответчиков» используются различные шкалы и биомаркеры, в т.ч. учет данных о взаимосвязи опухолевого микроокружения (англ. tumor microenvironment, TME) и ответа на иммунотерапию.

Микроокружение опухоли играет важнейшую роль в прогрессировании заболеваний и существенно влияет на терапию. TME состоит из клеток и внеклеточного матрикса, отвечающего за адгезию, пролиферацию клеток и межклеточные взаимодействия, опосредованные специальными сигнальными молекулами [3].

Для получения более полной информации о TME новые исследования сосредоточиваются на его составе, молекулярных особенностях и пространственной организации компонентов.

В настоящее время высока потребность в валидации методик секвенирования нового поколения (англ. next-generation sequencing, NGS) и поиске новых биомаркеров для оптимизации лечения онкологических заболеваний. На данный момент молекулярно-генетические методы широко применяются в онкологии. Однако, несмотря на их растущее признание, зачастую геномная характеристика опухоли сводится к использованию таргетных панелей, содержащих только ограниченное количество генов, которые фиксируют лишь малую часть онкогенных изменений.

В ряде работ внимание акцентируется на перспективности применения полноэкзомного (англ. whole exome sequencing, WES) и полнотранскриптомного (англ. RNA sequencing, RNA-seq) секвенирования опухолевых биопсий для всеобъемлющей характеристики опухоли. Например, у пациентов с аденокарциномой легкого WES превосходило таргетное секвенирование в оценке мутационной нагрузки опухоли (англ. tumor mutation burden, TMB) как биомаркера для иИКТ [4]. При сравнении успешности детекции таргетируемых альтераций с применением стандартной генетической панели и WES обнаружено, что с помощью WES удается найти в 3,4 раза больше генетических событий, важных для правильного выбора лечения. В исследовании M. Del Re et al. показана клиническая полезность использования комбинированных методик для лучшего понимания молекулярных детерминант ответа на иммунотерапию [5]. Тем не менее практически все авторы отмечают, что ошибки выравнивания, недостаточная чувствительность и высокая частота ложноположительных результатов при недостаточном покрытии создают определенные затруднения для реального широкого применения WES.

Множество ретроспективных исследований продемонстрировали, что TME стратифицирует ответ на терапию и является независимым прогностическим маркером [6–9]. A. Bagaev et al. на основе транскриптомного анализа более 10 тыс. онкологических пациентов выявили четыре различных подтипа TME, сохраняющихся при 20 различных видах рака [3]. Подтипы TME коррелировали с ответом пациентов на иммунотерапию при различных видах рака, причем пациенты, обладающие иммуноблагоприятными подтипами TME, получали наибольшую пользу от иммунотерапии. Таким образом, подтипы TME действуют как универсальный биомаркер для иммунотерапии во многих видах рака. В связи с этим валидация методов секвенирования для их последующего использования в реальной клинической практике и поиск новых биомаркеров ответа на новые виды терапии в онкологии имеют особую важность.

В настоящей работе рассмотрены перспективы применения технологий высокопроизводительного секвенирования для персонализированного подбора противоопухолевой терапии.

В области исследования и лечения рака концепция прецизионной медицины (стратегии профилактики и лечения, учитывающие индивидуальные особенности человека) основывается на разработке достоверных биомаркеров, выявляющих ключевые аберрантные пути, на которые потенциально могут быть направлены цитотоксические, таргетные, иммунные или клеточные методы лечения. Несмотря на то что такие биомаркеры, как простатспецифический антиген, были известны и использовались на протяжении десятилетий для принятия прогностических и терапевтических решений, недавняя революция в молекулярной биологии, вызванная расширением применения NGS, привела к экспоненциальному росту числа попыток измерения и обнаружения аберрантных сигнальных путей на молекулярном уровне [10].

С момента зарождения геномики в конце 1980-х гг. значительное внимание уделялось стоимости секвенирования одного генома человека. Например, американский Национальный институт исследования генома человека (англ. National Human Genome Research Institute, NHGRI) в течение многих лет тщательно отслеживал затраты на геном в финансируемых им центрах секвенирования генома (рис. 1) [11]. С ростом масштабов исследований в области генетики человека и увеличением числа клинических применений секвенирования генома еще большее внимание уделяется пониманию основных затрат на создание последовательности генома человека. Тем не менее существует большой разрыв между многочисленными сообщениями о биомаркерах и их клиническим внедрением.

В связи с большей доступностью NGS надежные и хорошо валидированные биомаркеры рака становятся все более необходимыми. Например, более 90% онкологических препаратов, по которым начинается клиническая разработка, не получают одобрения на рынке из-за того, что клинические испытания не смогли продемонстрировать терапевтический эффект, что приводит к дорогостоящей и медленной разработке лекарств от рака [12]. По признанию FDA, разумное использование биомаркеров должно сыграть важную роль в минимизации риска неудачи клинических испытаний путем обогащения популяций участников испытаний конкретными молекулярными подтипами, лучше реагирующими на тестируемые методы лечения.

Несмотря на достигнутый значительный прогресс, существует острая необходимость в открытии и разработке новых эффективных биомаркеров в области онкологии. На рисунке 2 представлены основные этапы поиска биомаркеров: открытие, разработка анализа / аналитическая проверка, клиническая проверка, клиническая польза и, наконец, клиническое внедрение [13–15].

Однако большинство современных методик поиска новых биомаркеров не валидированы, протоколы исследований не согласованы, отсутствует единая регуляция [10]. Эти недостатки, по-видимому, являются основными причинами разрыва между широким спектром биомаркеров в области онкологии, которые оказались эффективными в отдельных исследованиях, и относительно небольшим количеством биомаркеров, готовых к внедрению в клинику. Следовательно, наиболее сложной задачей в краткосрочной перспективе может стать не поиск новых молекул и путей, а валидация роли существующих методов, чтобы сократить разрыв между лабораторными и клиническими исследованиями [16].

В основе так называемых омиксных технологий (геномика, эпигеномика, транскриптомика, протеомика, интерактомика, метаболомика) лежат методы секвенирования нуклеиновых кислот, в т.ч. бисульфитные, масс-спектрометрия, математическое моделирование и т.д.

Омиксные данные, первоначально использовавшиеся для проведения анализа, ориентированного непосредственно на опухоль (англ. tumor intrinsic features), теперь применяются для извлечения дополнительных характеристик, описывающих клеточную и молекулярную гетерогенность ТМЕ.

Данные RNA-seq могут использоваться отдельно либо в сочетании с данными секвенирования полного экзома или генома для предсказания специфических для пациента раковых неоантигенов, возникающих в результате соматических мутаций, нарушений копийности, слияний генов или альтернативно сплайсированных транскриптов. Предполагаемые неоантигены, которые способны вызвать противораковый ответ, могут быть предсказаны вычислительным путем с помощью трех основных этапов:

В июле 2017 г. два клинических исследования продемонстрировали успешное лечение прогрессирующей меланомы на основе персонализированных неоантигенов [17][18]. Однако потенциал этих стратегий все еще ограничен из-за сложности прогнозирования иммуногенности неоантигена in silico.

Транскриптомные данные также могут быть использованы для количественной оценки различных типов клеток ТМЕ с помощью анализа обогащения набора генов (англ. gene set enrichment analysis, GSEA) или деконволюции. В то время как GSEA может оценить только обогащение типов клеток в образце, методы деконволюции позволяют количественно оценить относительные фракции клеток, рассматривая профиль экспрессии опухолей как «конволюцию» клеточно-специфических сигнатур [3].

RNA-seq дает разрешение на уровне одного основания, что позволяет проводить анализ на уровне последовательности, например выявлять слитые транскрипты, что невозможно сделать на основе данных микрочипов. Традиционные методы «массового» RNA-seq анализируют смесь всех клеток, частично усредняя различия в транскриптомах, специфичных для каждого типа клеток. В отличие от этого, РНК-секвенирование единичных клеток (англ. single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) профилирует картину экспрессии генов каждой отдельной клетки и расшифровывает ее межклеточные сигнальные сети. Такая непредвзятая характеристика дает четкое представление обо всей экосистеме опухоли и взаимодействии клеток посредством лиганд-рецепторной сигнализации, однако является крайне дорогой методикой, что осложняет ее реальное применение в клинической практике. Одна из важных проблем в анализе данных scRNA-seq, которая приводит к возникновению всех этих сложностей, – так называемое выпадение (англ. dropout), когда ген наблюдается на низком или умеренном уровне экспрессии в одной клетке, но не обнаруживается в другой клетке того же типа [19]. Выпадения происходят из-за малого количества матричных РНК (мРНК) в отдельных клетках и неэффективного захвата мРНК, а также из-за стохастичности экспрессии мРНК. В результате данные scRNA-seq часто оказываются очень разрозненными. Чрезмерное количество нулевых значений приводит к тому, что данные занижаются, захватывая лишь небольшую часть транскриптома каждой клетки.

Метилирование цитозина в ДНК – это эпигенетическая модификация, участвующая в регуляции экспрессии генов. Оно происходит преимущественно в контексте цитозина и гуанина, разделенных фосфатом (англ. cytosine-phosphate-guanine, CpG), которые более многочисленны в отдельных регионах генома. Бисульфитное секвенирование с уменьшенной репрезентативностью (англ. reduced-representation bisulfite sequencing, RRBS) – это мощный подход к анализу метилирования ДНК, который сочетает в себе обработку рестрикционными ферментами и бисульфитное секвенирование для обогащения CpG-плотной фракции генома. Такое сочетание делает RRBS более эффективным в использовании образцов и идеальной платформой для пилотных исследований и клинических приложений. RRBS секвенирует только фрагменты, относящиеся к CpG-богатым регионам, что значительно снижает стоимость по сравнению с бисульфитным секвенированием всего генома. RRBS является очень экономически эффективным, учитывая, что секвенированию подвергается около 1–5% генома, охватывая около 12% геномных CpG-сайтов и около 84% CpG-островков в промоторах [20].

Отдельного внимания заслуживают бурно развивающиеся методы мультиплексной иммуногистохимии (ИГХ). В отличие от обычной ИГХ, которая позволяет маркировать только один-единственный маркер в образце ткани, мультиплексная ИГХ способна обнаружить множество маркеров в одном образце ткани, предоставляя при этом полную информацию о составе и пространственном расположении клеток [21].

ИГХ и молекулярные тесты играют важную роль в диагностике и лечении рака. Однако именно ИГХ является «золотым стандартом» для прогнозирования терапевтического ответа на эндокринную, таргетную и иммунную терапию [22–26]. Кроме того, эти анализы на основе тканей, закрепленных в формалине и пропитанных парафином (англ. formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE) в настоящее время используются в клинической практике для классификации или прогнозирования риска рецидива у пациентов, страдающих различными типами опухолей.

Хотя ИГХ-оценка рецепторов к эстрогену (англ. estrogen receptors, ER) и прогестерону (англ. рrogesterone receptor, PR), человеческого рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (англ human epidermal growth factor receptor 2, HER2), онкогенного белка Ki67 и PD-L1 в опухолевых образцах является возможным биомаркером, ее потенциальное использование ставит множество вопросов и проблем как перед онкологами, так и перед патоморфологами [27–30]. Для измерения уровня белка используются различные клоны антител, платформы окрашивания и системы оценки ИГХ, а также клинические критерии отсечения. Например, в образцах немелкоклеточного рака легкого патоморфологи могут оценить экспрессию PD-L1 по проценту положительных опухолевых клеток клона SP263, при раке молочной железы – по комбинированным положительным показателям (англ. combined positive score, CPS) клона 22C3, а при уротелиальной карциноме необходимо подсчитать иммунные клетки клона SP142 в микро-окружении опухоли [26]. Онкологи должны знать различные методы подсчета баллов для каждой платформы окрашивания, клона, отсечки, которые адаптированы к различным диагнозам.

Различия в клонах и методах оценки способствуют получению неконсистентных результатов в клинических испытаниях и повседневной практике. Более того, гетерогенность опухоли затрудняет достоверность уровней экспрессии белков, оцененных с помощью ИГХ, для прогнозирования клинического ответа [31][32]. Также появляются новые доказательства того, что отсечение позитивности, основанное на тестах ИГХ, должно обновляться по мере появления новых терапевтических возможностей [31][33]. Например, для каждого HER2-таргетного препарата, конъюгированного с антителами [34], должны быть приняты различные определения сверхнизкой и низкой позитивности HER2. Помимо HER2 внутриопухолевая гетерогенность играет важную роль в модуляции ответа на анти-HER2-терапию и ассоциируется с худшими результатами лечения пациентов в плане меньшей общей и безрецидивной выживаемости [35][36]. Полезность обнаружения PD-L1 с помощью ИГХ на основе различных одобренных FDA анти-PD-L1-антител в прогнозировании результатов лечения при светлоклеточном почечно-клеточном раке также вызывает споры, поскольку имеет место корреляция с более низкой выживаемостью, но не с реакцией пациента на блокаду ИКТ [37][38].

Количественные измерения экспрессии мРНК с помощью RNA-seq могли бы в дальнейшем помочь лучше стратифицировать прогностические группы и выявить пациентов, у которых терапия будет эффективна [39–42]. Считающийся «золотым стандартом» транскриптомного профилирования анализ RNA-seq обеспечивает высокую чувствительность и специфичность целевых биомаркеров, которые отражают динамические регуляторные процессы в раковых клетках, позволяя одновременно измерять несколько мишеней [43]. Он имеет дополнительное значение для экономии опухолевой ткани в случае ограниченного материала. Таким образом, измерение прогностических биомаркеров с помощью RNA-seq обладает потенциалом для выбора терапии рака [31][39][43]. Также экспрессия на основе RNA-seq дает потенциал для выявления ИГХ-негативных опухолей и может служить дополнительным инструментом для контроля качества ИГХ-биомаркеров.

Различные требования к интерпретации ИГХ для определения процентного соотношения или балльной оценки опухолевых, иммунных или комбинированных клеток часто являются источником ошибок. Интеграция RNA-seq с текущим тестированием ИГХ может минимизировать вариабельность оценки ИГХ, особенно при ограниченном количестве ткани, что в конечном итоге будет способствовать принятию верных клинических решений и влиять на эффективность персонализированного лечения онкологии [39].

Многие современные парадигмы лечения рефрактерных опухолевых заболеваний ведут пациентов по пути многократной комбинированной терапии цитотоксическими препаратами в надежде на долгосрочный безрецидивный период или для последующей трансплантации аутологичных стволовых клеток. Однако часто возникают ограничивающие лечение токсические эффекты, а повторные курсы цитотоксической химиотерапии дают меньшую отдачу.

На сегодняшний день сложно переоценить новые направления в фармакотерапии опухолей: иммунотерапия, в т.ч. адаптивная, таргетная терапия и клеточная терапия. Тем не менее биомаркеров, которые могли бы надежно предсказывать ответ или резистентность к потенциальному лечению, крайне мало или нет совсем. Все это делает актуальным вопрос персонификации противоопухолевой терапии и поиска предиктивных маркеров. Данные литературы свидетельствуют о том, что все большее внимание уделяется транскриптомным и генетическим находкам, которые могут уточнить прогноз пациента. Также остро стоит проблема тщательной аналитической и клинической валидации новых методов для применения в реальной клинической практике.