Коронавирус второго типа, вызывающий тяжелый респираторный синдром и впервые выявленный в конце 2019 г., относится к семейству Coronaviridae, широко распространенному в среде млекопитающих. До 80% случаев инфекции SARS-CoV-2 протекают бессимптомно [1–3], при этом носители могут заражать других лиц [4].

Симптомы COVID-19 часто схожи с проявлениями других респираторных инфекций, потому необходимы высокоспецифичные и чувствительные методы, позволяющие проводить дифференциальную диагностику. Основным методом этиологической диагностики как острых респираторных вирусных инфекций, так и COVID-19 является исследование биологического материала из верхних и нижних дыхательных путей с помощью амплификации нуклеиновых кислот, наиболее распространенный из которых – метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР)1.

Кроме того, лабораторная диагностика используется в целях организации противоэпидемиологических мер, в т.ч. тестирования людей, прибывших из мест с неблагоприятной эпидемиологической обстановкой, контактных лиц, даже не имеющих симптомов заболевания2.

У коронавирусов есть механизмы редактирования ошибок РНК-зависимой РНК полимеразы (RdRP), поэтому скорость мутаций ниже, чем у других РНК-содержащих вирусов [5]. Однако это не исключает накопления замен в геноме вируса [6][7]. Центр по контролю и профилактике болезней (Center for Disease Control and Prevention, CDC) Китая рекомендует использовать для тестирования два участка генома вируса – ORF1ab и ген N [8], CDC США – три участка гена N [9]. Также показали эффективность тест-системы, выявляющие коронавирус нового типа по другим генам – ORF1a, ORF1ab, RdRP, E, N, S [10][11].

Цель – разработка и валидация набора реагентов для качественного определения рибонуклеиновых кислот (РНК) коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, адаптированной для использования совместно с наборами для экстракции РНК в автоматическом режиме.

Предел обнаружения определяли с использованием стандартного образца SARS-CoV-2 (EDX SARS-CoV-2 Standard, Bio-Rad, США). Стандарт представляет собой синтетические РНК-транскрипты, содержащие 5 генов коронавируса (E, N, ORF1ab, RdRP и S). Разведение стандарта до концентраций 1000, 500, 250 и 100 копий/мл осуществляли на образцах мазков со слизистой рото- и носоглотки, не содержащих РНК коронавируса нового типа.

Экстракцию РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиПрайм ФАСТ-Р» (ООО «НекстБио», Россия) по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet (Hamilton Bonaduz AG, Швейцария, регистрационное удостоверение № РЗН 2018/6981 от 5 апреля 2018 г.).

Воспроизводимость и повторяемость определяли тестированием 60 повторов клинических образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2 в концентрации 104 копий/мл, полученных из Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В. Склифосовского после проведения плановых исследований.

Концентрацию SARS-CoV-2 определяли относительно стандартных образцов предприятия (ООО «НекстБио», Россия). Экстракцию РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиПрайм ФАСТ-Р» по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet.

Клинические испытания были проведены с использованием биологического материала, полученного в ходе лечебно-диагностического процесса после проведения плановых лабораторных исследований. Исследованный материал включал:

Биологический материал мазков со слизистой носо- и ротоглотки был забран в транспортную среду для хранения и транспортировки респираторных мазков (ООО «НекстБио», Россия, РУ № ФСР 2012/14200).

Экстракцию РНК из 100 мкл биоматериала проводили с помощью наборов реагентов «МагноПрайм ЮНИ» (ООО «НекстБио», Россия) по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet и «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБио», Россия) в ручном режиме. Тесты ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) выполняли на приборах планшетного типа (С1000 Touch в комплекте с модулем CFX96, Bio-Rad Laboratories, США) и роторного типа (Rotor-Gene Q, Qiagen, Германия).

Аналитическую специфичность набора оценивали тестированием нуклеиновых кислот микроорганизмов и вирусов и геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) человека. Нуклеиновые кислоты микроорганизмов и вирусов в концентрации не менее 106 копий/мл и геномную ДНК человека в концентрации 1 мкг/мл вносили в образцы биологического материала, не содержащие вирус SARS-CoV-2.

В исследование были включены следующие микроорганизмы: B. parapertussis, B. pertussis, B. bronchiseptica, H. influenzaе, K. pneumonia, S. aureus, S. pneumoniae, L. pneumophilia, P. aeruginosa, вирусы гриппа А H1N1, H3N2, H2N2, H7N9, H0N1, H5N1, вирус гриппа В линии Брисбен, вирус гриппа В линии Пхукет, коронавирусы человека 229Е, NL63, OC43.

Для оценки влияния интерферирующих веществ в исследуемые образцы были внесены муцин (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,23 мг/100 мкл, гемоглобин (Sigma-Aldrich, США) – 0,20 ммоль/100 мкл, мирамистин (ООО «Инфамед К», Россия) – 0,001% действующего вещества в 100 мкл, хлоргексидин (ОАО НПЦ «Биоген», Россия) – 0,5% действующего вещества в 100 мкл.

В качестве набора сравнения был использован набор реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (АО «Вектор-Бест», Россия). Экстракцию РНК из образцов биоматериала выполняли с помощью набора «РеалБест УниМаг» (АО «Вектор-Бест», Россия), тесты ОТ-ПЦР – на приборе Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия).

Биологический материал, использованный для проведения работы, был получен после рутинных исследований. Дизайн исследования не был связан с риском для пациентов и не оказывал влияния на их права и благополучие. Способ получения материала не позволял провести идентификацию лица, от которого данный материал был получен. Исходя из этого одобрения этического комитета не требовалось.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета Excel MS Office (Microsoft, США). Расчет клинической чувствительности (Ч) выполняли по формуле:

Ч = А / (А + В),

где А – количество истинно-положительных результатов; В – количество ложноотрицательных результатов.

Расчет клинической специфичности (Сп) проводили по формуле:

Сп = D / (D + C),

где D – количество истинно-отрицательных результатов; С – количество ложноположительных результатов.

Расчет нижней границы 95% доверительного интервала чувствительности (Чн) и специфичности (Спн) выполняли по формулам [12]:

где Zγ – значение γ-квантиля нормального распределения (γ =1−α/2, α = 0,05).

Для контроля качества экстракции использовали внутренний контрольный образец, представляющий собой модифицированный фаг MS2. Отсутствие сигнала по внутреннему контролю говорит о неэффективной экстракции РНК из клинического материала, образец признается невалидным, требуется его повторный анализ начиная с этапа экстракции. Все результаты признаны валидными на основании амплификации внутреннего контрольного образца.

Контроль качества проведения анализа осуществляли с помощью положительного контрольного образца, представляющего собой модифицированный фаг MS2, несущий фрагмент РНК SARS-CoV2.

Для валидации автоматического метода экстракции РНК из клинического материала была проведена одновременная экстракция наборами реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ручной метод) и «МагноПрайм ЮНИ» с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet. При использовании двух выделительных наборов, а также при проведении ОТ-ПЦР на двух приборах не было получено ни одного ложноположительного и ложноотрицательного результата. Все полученные результаты совпали.

Время, затрачиваемое на проведение экстракции РНК из 96 образцов с использованием станции Microlab STARlet, составило 1 ч 10 мин. Экстракция РНК набором реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» из 12–24 образцов занимает 45 мин. Длительность программы амплификации составляет 90 мин. Таким образом, общее время, затрачиваемое на анализ при использовании автоматической станции, укладывается в 3 ч.

Результаты определения предела обнаружения при тестировании разведения стандартного образца SARS-CoV-2 представлены в таблице 1, результаты исследования повторяемости и воспроизводимости – в таблице 2.

При исследовании аналитической специфичности перекрестных реакций с указанными возбудителями не выявлено.

Для исследования клинической специфичности и чувствительности нового набора были изучены 244 образца биологического материала одновременно с референсным набором «РеалБест РНК SARS-CoV-2». Все полученные результаты были признаны валидными на основании амплификации внутреннего контроля образца в исследуемом и референсном тестах.

При исследовании 132 образцов мазков со слизистой носои ротоглотки обнаружено 66 образцов, содержащих РНК SARS-COV-2, из 112 образцов мокроты – 56 положительных. Исследование с использованием референсного набора показало полное совпадение положительных и отрицательных результатов. На основании полученных данных была рассчитана диагностическая чувствительность и специфичность с учетом 95% доверительной вероятности. Результаты представлены в таблице 3.

Внесение в клинический материал интерферирующих веществ в указанных концентрациях не привело к получению ложноотрицательных результатов.

Молекулярно-биологические методы выявления РНКи ДНК-возбудителей респираторных инфекций широко применяются в клинической практике и служат как для установления этиологической причины заболевания, так и для эпидемиологического надзора. Как показывают события 2020–2021 гг., это играет первостепенную роль в предотвращении распространения пандемии.

По данным коммуникационного штаба Правительства Российской Федерации [13], на начало ноября 2021 г. количество ПЦР-исследований составило более 500 тыс. в день, из них более 40 тыс. были положительными. Такое количество выполняемых анализов неизбежно означает огромную нагрузку на клинико-диагностические лаборатории, поэтому необходимы решения, которые позволили бы проводить исследования в максимально автоматическом режиме и при этом оставались бы экономически оправданными.

Одной из основных задач нашей работы было определение аналитических и диагностических характеристик разработанного набора реагентов с использованием автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот.

Чувствительность набора реагентов при тестировании стандартного образца EDX SARS-CoV-2 составила 250 копии/мл, что равно 0,25 копии/мкл, или 2,5 копии на реакцию. Для сравнения, по имеющимся литературным данным, чувствительность анализа при использовании олигонуклеотидов, предложенных CDC для выявления SARS-CoV-2, составила от 0,3 до 2,1 копии/мкл [14]. Из отечественной практики опубликованы данные об аналитических характеристиках набора реагентов производства ООО «ДНК-Технология» с чуть более низкой чувствительностью: 10 копий на реакцию [15]. Основным различием проведенных исследований является использование нами внешнего количественно охарактеризованного стандартного образца, содержащего РНК SARS-CoV-2, что, возможно, позволило более точно определить чувствительность набора реагентов.

Коэффициент вариации при исследовании воспроизводимости результатов амплификации составил менее 5%. По литературным данным, при валидации наборов реагентов либо были получены схожие значения (не более 5%) [16], либо коэффициент вариации был выше (от 1,16% до 8,65%) [17].

Автоматические станции для выделения нуклеиновых кислот и приготовления ПЦР-смесей имеют ряд преимуществ перед ручными методами экстракции, в первую очередь за счет большей пропускной способности и стандартизованности процедуры экстракции. Длительность исследования с помощью станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet при анализе 96 образцов составила 1 ч 10 мин. Экстракция такого же количества образцов ручным методом занимает около 3 ч. При использовании автоматической станции весь анализ, включая этап экстракции и амплификации, длится на более 3 ч.

Важным этапом валидации набора реагентов является сравнение результатов с другим набором реагентов, зарегистрированным в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения в установленном порядке. В качестве набора сравнения нами был использован набор реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2». Различия в результатах могут быть связаны с разными областями генома, амплифицируемыми в ходе анализа, разной чувствительностью и методами экстракции нуклеиновых кислот. Несмотря на имеющиеся различия, сравниваемые наборы реагентов показали схожую чувствительность и специфичность.

В ходе исследования был разработан и апробирован набор реагентов «АмплиПрайм SARS-CoV-2 DUO» (ООО «НекстБио», Россия) для выявления коронавируса нового типа. Набор определяет SARS-CoV-2 по двум фрагментам генома, что позволяет повысить надежность анализа. Предел обнаружения составил 250 копий/мл, что достаточно для надежного анализа. Коэффициент вариации при тестировании 120 образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2 в концентрации 104 копий/мл, не превышает 5%.

Набор реагентов получил регистрационное удостоверение РЗН № 2020/10837 от 15 июня 2020 г. и может быть использован в клинической практике.

1. Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». Версия 15 (22.02.2022). 2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.3597-20 «Профилактика новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» от 22.05.2020 № 15.