Увеличение потребления омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ω-3 ПНЖК) достоверно ассоциировано с дозозависимым снижением смертности от всех причин [1]. Детальный аудит доказательных публикаций по ω-3 ПНЖК, проведенный посредством современных математических методов анализа больших данных [2], подтвердил существование обширной клинической базы, указывающей на обоснованность использования стандартизированных препаратов на основе ω-3 ПНЖК для снижения сердечно-сосудистой смертности.

Аудит доказательных публикаций [2] указал на необходимость изучения количественного состава препаратов на основе ω-3 ПНЖК. Сравнительное исследование состава 10 образцов ω-3 ПНЖК с хроматографическим определением более 40 метаболитов жирных кислот и других соединений позволило разработать количественные маркеры для идентификации более стандартизированных образцов ω-3 ПНЖК – «эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) + докозагексаеновая кислота (ДГК)», «ω-6 + ω-11», коэффициент стандартизации и др. [3].

Анализ количественного и качественного состава фармацевтических образцов ω-3 ПНЖК показал, что в них входят разные формы ω-3 ПНЖК (триглицериды, карбоновые кислоты, этиловые эфиры) (рис. 1, а). Каждая из этих форм имеет химические особенности, отражающиеся на их фармакологических свойствах. Молекулы триглицеридов (сложные эфиры с глицерином) достаточно громоздки: остаток глицерина – многоато́мный спирт, он включает три гидроксильные (-ОН) группы (рис. 1, b). Для взаимодействия с таргетными белками триглицериды должны предварительно гидролизоваться до свободных ПНЖК, что неизбежно сказывается на фармакокинетике образцов ω-3 ПНЖК, содержащих триглицериды.

Свободные ПНЖК, как правило, представлены в организме в диссоциированной форме и характеризуются отрицательным зарядом в карбоксильной группе (-СОО–). Заряд карбоксила меняется в зависимости от рН и может воспрепятствовать взаимодействию с таргетными белками. Этиловые эфиры, в отличие от триглицеридов, могут взаимодействовать с таргетными белками без предварительного гидролиза эфира до ПНЖК и спирта (см. рис. 1, b). В отличие от свободных жирных кислот в этиловых эфирах ω-3 ПНЖК некомпенсированный отрицательный заряд карбоксильной группы отсутствует.

Приведенные выше аргументы носят качественный характер, так что их следует дополнить количественными оценками взаимодействия рассматриваемых молекул с таргетными белками. Как известно, ω-3 ПНЖК характеризуются значительными противовоспалительными и вазодилаторными свойствами в связи с их влиянием на метаболизм простагландинов через каскад арахидоновой кислоты (АРК) [4]. В ходе биотрансформаций в каскаде АРК ПНЖК трансформируются циклооксигеназами (ЦОГ) в простаноиды (простагландины, простациклины, тромбоксаны), а посредством липоксигеназ (ЛПОГ) – в лейкотриены. В отличие от АРК ω-3 ПНЖК и их производные проявляют гораздо меньшее провоспалительное действие – наоборот, предотвращают синтез провоспалительных простаноидов [5][6] и способствуют синтезу противовоспалительных [7], нейропротекторных [8] и вазодилаторных простаноидов [9]. Более того, ω-3 ПНЖК необходимы для биосинтеза медиаторов разрешения воспаления – резолвинов, нейропротектинов, маресинов и др. [10].

Как видно из приведенного выше краткого экскурса в биохимию ω-3 ПНЖК, наиболее важными белками – рецепторами ω-3 ПНЖК являются ЦОГ и ЛПОГ. Взаимодействия различных форм ω-3 ПНЖК перспективно исследовать именно с этими ферментами. Расчет значений энергий взаимодействия исследуемых таргетных молекул с вышеупомянутыми таргетными белками ранее не проводился. Оценка сродства различных форм ПНЖК к этим таргетным белкам позволяет выявить те формы ω-3, от которых следует ожидать наибольшего терапевтическего эффекта.

Цель – провести биофизический анализ взаимодействий различных форм ПНЖК (АРК, ЭПК, ДГК, этиловые эфиры ЭПК и ДГК) с тремя таргетными белками – ферментами каскада АРК (ЦОГ-1, ЦОГ-2, 5-ЛПОГ).

Исследование проводилось современными методами биофизического моделирования и биоинформатики, включающими расчет энергий взаимодействий в комплексах «молекула–рецептор».

Химические структуры исследованных ПНЖК приведены на рисунке 1. Выбор молекул для исследования очевиден: АРК – основной субстрат каскада АРК, ЭПК и ДГК – формы «морских» ω-3 ПНЖК с наибольшей базой клинико эпидемиологических исследований. Этиловые эфиры ДГК и ЭПК – действующие начала препарата ω-3 ПНЖК, который характеризуется наибольшей доказательной базой среди препаратов ω-3 ПНЖК.

В работе исследовались взаимодействия этих ПНЖК с ЦОГ-1, ЦОГ-2 и 5-ЛПОГ. Модели пространственных структур указанных ферментов были приготовлены на основе структур, имеющихся в базе данных Protein Data Bank (PDB)1, содержащей все известные к настоящему времени структуры белков, определенные посредством диффракционных экспериментов или ядерного магнитного резонанса (табл. 1). Структуры из PDB были отобраны с учетом: 1) наличия в соответствующих файлах информации о сайтах связывания лигандов (жирных кислот и коферментов); 2) качества эксперимента по установлению пространственной структуры. В случае ЦОГ коферментами являлись протопорфирин с ионом кобальта, а в случае 5-ЛПОГ – ион трехвалентного железа.

На основе отобранных из базы данных PDB-файлов были приготовлены модели структур ферментов человека (методика описана в [11]). Затем были исследованы возможности размещения молекул ω-3 ПНЖК в связывающих карманах ферментов. Для этого проводилась минимизация энергии комплексов «лиганд– рецептор» при различных начальных расположениях молекулы относительно кармана рецептора.

В данной работе для анализа структур комплексов ферментов с ПНЖК использовался метод молекулярных энергетических профилей. Молекулярные энергетические профили являются новой концепцией в биоинформатике и биофизике белка. Они используются для определения аминокислотных остатков в структуре белка, которые обладают экстремальными (наиболее высокими или наиболее низкими) значениями энергии переноса боковой цепи из растворителя в белок (ΔGост). Остатки с экстремальными значениями ΔGост часто являются наиболее важными для реализации биологических функций белка [11].

Молекулярные энергетические профили представляет собой список значений ΔGост для каждого остатка в белке. Список упорядочен в соответствии с порядковыми номерами остатков в аминокислотной последовательности белка-рецептора. Для заданной трехмерной структуры белка значения ΔGост рассчитываются с использованием методов классической молекулярной механики. Процедура расчета состоит из двух этапов: минимизации энергии молекулярной системы и собственно расчета ΔGост. Ниже приводится детальное описание этого вычислительного метода.

Минимизация энергии

Минимизация полной энергии осуществлялась посредством алгоритмической комбинации, которая включает перемежающиеся стадии минимизации энергии посредством конъюгированных градиентов и коротких периодов молекулярной динамики. Подобного рода комбинация (названная «интерактивной оптимизацией») позволяет избежать «застревания» системы в локальных минимумах. Интерактивная оптимизация является итеративной процедурой. Один цикл минимизации состоит из 50...200 шагов минимизации конъюгированных градиентов, за которой следует 100...1000 фемтосекунд молекулярной динамики. Применение метода конъюгированных градиентов в молекулярной механике заключается в смещении каждого атома в направлении действующих на этот атом сил. Для молекулы из N атомов сила, действующая на каждый атом, определяется как:

где Uполн – полная внутренняя энергия молекулярной системы, j = 1...N.

Для i-го шага минимизации по конъюгированным градиентам новые координаты каждого атома определяются как:

Uполн молекулярной системы, содержащей N атомов, B ковалентных связей (связывающих термов), A угловых термов и T торсионных термов, определяется как

где Ejсвяз – терм энергии j-й ковалентной связи; Ejугл – терм энергии j-го углового изгиба двух ковалентных связей; Ejторс – терм энергии вращения j-го диэдрального угла.

Терм несвязывающих взаимодействий определяется как сумма электростатического и Вандерваальсового термов:

Электростатические взаимодействия описываются законом Кулона:

а Вандерваальсовы – посредством потенциала Леннарда–Джонса:

Силовые константы Kb, Kθ, Vm, равновесные значения связей и углов r0, θ0, φ0, а также константы Ajk, Bjk определены в соответствии с потенциалом UFF. Значения частичных атомных зарядов qj, qk определены на основе потенциала AMBER при составлении которого использовались квантово-механические расчеты. Вычисления проводили посредством пакета ECMMS [10].

Молекулярная динамика

Процедура молекулярной динамики основана на втором законе Ньютона

Значения ускорений aj индивидуальных атомов находятся на основе Uполн (см. выше), а затем численно интегрируются с использованием алгоритма Верле. Скорости и координаты в следующий момент времени t + Δt:

Начальные скорости атомов были рандомизированы в соответствии с распределением Максвелла:

Температура системы фиксировалась в соответствии с равенством:

Для расчетов использовались T = 300K и ε = 1.

Расчет энергий переноса

Расчеты энергий переноса боковой цепи из растворителя в белок (ΔGост) проводили на основе несвязывающего потенциала, определяемого на основании вышеприведенных уравнений молекулярной механики и терма энергии сольватации. Таким образом, ΔGост i-го аминокислотного остатка, состоящего из k атомов:

В данном случае ΔEiнесвяз представляет собой разность между несвязывающей энергией взаимодействия атомов аминокислотного остатка со всеми атомами белка и энергией взаимодействия атомов внутри аминокислотного остатка:

и определяется как:

где j = 1...k соответствует суммированию по атомам i-го аминокислотного остатка [10].

ΔΔGiсольв вычислялась как разность между термами сольватации внутри и вне белка:

где δj– атомный сольватационный параметр, полученный на основании экспериментов по определению LogP в системе «октанол– вода», a ΔSAj– изменение доступности поверхности растворителю при переносе остатка из вакуума в белок.

Получены полноатомные пространственные структуры комплексов исследованных молекул с таргетными белками. Затем проведен расчет энергий связывания и измерены молекулярные энергетические профили. В последующих разделах полученные результаты расчетов предваряются краткими введениями по биологии соответствующих ферментов.

Основным параметром, позволяющим оценить сродство той или иной молекулы к определенному белку-рецептору, является ∆∆G – изменение свободной энергии (∆G) образования комплекса «молекула–рецептор» минус изменение свободной энергии молекулы рецептора при отсутствии связанного лиганда. Для стабильных комплексов значения ∆∆G отрицательны. Чем меньше значение ∆∆G (т.е. чем больше абсолютное значение ∆∆G), тем больше стабильность комплекса и тем выше сродство соответствующего лиганда к таргетному белку.

В таблице 2 и на рисунке 2 суммированы результаты расчетов ∆∆G по всем вычислительным экспериментам, проведенным в ходе исследования. Как видно из расчета энергий связывания, ω-3 ПНЖК и их производные характеризовались бóльшими по сравнению с АРК абсолютными значениями энергий связывания ∆∆G с белками-рецепторами.

Существует две разновидности циклооксигеназ (также известных как простагландин Н2 синтетазы) – ЦОГ-1 и ЦОГ-2. Обе разновидности на 65% идентичны по аминокислотной последовательности и практически идентичны по пространственной структуре. Ткани организма отличаются друг от друга по уровням экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2. ЦОГ-1 экспрессируется в большинстве клеток и является необходимым ферментом для биосинтеза простагландинов. ЦОГ-2 – индуцибельный фермент, который экспрессируется в активированных макрофагах и других клетках при воспалении.

Результаты расчета энергий связывания (см. рис. 2) показывают, что ЭПК, ДГК и их этиловые эфиры характеризуются более высокими абсолютными значениями энергий связывания с ЦОГ-1 и ЦОГ-2 по сравнению с ω-6 АРК. За исключением комплекса ЭПК–ЦОГ-1, энергии связывания ЭПК и ДГК на 0,4…1,8 ккал/моль превышали абсолютные значения энергии стабилизации комплексов АРК–ЦОГ-1 и АРК–ЦОГ-2. В случае ЦОГ-2 ЭПК, ДГК и этиловый эфир ЭПК характеризовались близкими значениями ∆∆G (–3,0...–3,1 ккал/моль), в то время как комплекс ЦОГ-2 с этиловым эфиром ДГК был несколько более стабилен (∆∆G = –3,4 ккал/моль).

Анализ молекулярно-энергетических профилей (рис. 3) показал, что этот выигрыш в энергии стабилизации комплексов обусловлен не изменениями в характере взаимодействий каких-либо отдельных аминокислотных остатков, а более эффективной (по сравнению с АРК) аккомодацией молекул ω-3 ПНЖК и их производных в структуре таргетных белков ЦОГ-1 и ЦОГ-2.

Анализ молекулярно-энергетических профилей, представленных на рисунке 3, позволил сделать вывод, что более высокая стабильность структур этиловых эфиров ЭПК и ДГК обусловлена взаимодействиями этилового «хвоста» с гидрофобным карманом в структуре ЦОГ (рис. 4). Например, в структуре ЦОГ-1 гидрофобный карман сформирован аминокислотами валин-116, аргинин-120, аланин-527, лейцин-531. Этиловый «хвост» молекулы эфира увеличивает площадь ее поверхности по сравнению со свободной ПНЖК, тем самым увеличивая площадь поверхности взаимодействия этиловых эфиров ЭПК и ДГК с рецептором. Поскольку взаимодействия гидрофобные, увеличение площади взаимодействия молекул с ЦОГ приводит к увеличению стабильности комплексов «лиганд–ЦОГ».

Арахидонат 5-ЛПОГ (ген Alox5) преобразует ПНЖК в лейкотриены. Липоксигеназный путь синтеза лейкотриенов существует в различных лейкоцитах, включая мастоциты (тучные клетки), эозинофилы, нейтрофилы, моноциты и базофилы. Трансформации АРК посредством 5-ЛПОГ приводят к образованию провоспалительных лейкотриенов 4-й группы (LTB4, LTC4, LTD4, LTE4). При действии 5-ЛПОГ на ЭПК синтезируются противовоспалительные лейкотриены 5-й группы (LTB5, LTC5, LTD5, LTE5). 

Расчеты, представленные в настоящей работе, показывают, что комплексы ω-3 ПНЖК с 5-ЛПОГ намного более стабильны (∆∆G = –0,95...–1,62 ккал/моль), чем комплекс АРК с 5-ЛПОГ (∆∆G = –0,69 ккал/моль). Наиболее стабильным был комплекс 5-ЛПОГ с этиловым эфиром ЭПК (∆∆G = –1,62 ккал/моль). Анализ молекулярно-энергетических профилей комплексов 5-ЛПОГ с ДГК и этиловым эфиром ДГК продемонстрировал, что обе молекулы имеют близкие значения энергии связывания (∆∆G = –1,21... –1,23 ккал/моль) вследствие сравнительно малого объема связывающего сайта ПНЖК в структуре фермента 5-ЛПОГ.

Меньший объем сайта связывания ДГК приводит к тому, что добавление этилового «хвоста» не только обеспечивает увеличение поверхности взаимодействия с белком-рецептором, но и усиливает стерические препятствия (пространственные напряжения) в структуре фермента. Поэтому увеличение поверхности молекулы этилового эфира ДГК компенсируется возрастанием стерических препятствий, так что не происходит значительного увеличения энергии связывания с 5-ЛПОГ. В то же время объем молекулы ЭПК меньше, чем объем ДГК на 5...10 Å3, поэтому этиловый эфир ЭПК образует более стабильный комплекс с 5-ЛПОГ (рис. 5).

В работе представлены результаты биофизического анализа взаимодействий АРК, ЭПК, ДГК и этиловых эфиров ЭПК и ДГК с ЦОГ-1/2 и 5-ЛПОГ. Исследование привело к нескольким выводам, весьма интересным с точки зрения молекулярной фармакологии ЭПК и ДГК.

Во-первых, ЭПК и ДГК могут образовывать намного более стабильные комплексы с ферментами ЦОГ-1/2 и 5-ЛПОГ, чем АРК. С одной стороны, этот результат соответствует вытеснению АРК из активных центров таргетных ферментов, что приводит к замедлению образования провоспалительных эйкозаноидов. С другой стороны, более стабильные комплексы с таргетными белками соответствуют более интенсивному образованию противовоспалительных эйкозаноидов из ЭПК и ДГК.

Во-вторых, этиловые эфиры ЭПК и ДГК образуют более стабильные комплексы с ферментами каскада АРК, чем свободные ЭПК и ДГК. Результаты биофизического моделирования показали, что это обусловлено увеличением площади поверхности молекулы при присоединении этилового «хвоста» в составе сложных эфиров ЭПК и ДГК.

В-третьих, разница в молекулярном объеме между ЭПК и ДГК (ЭПК – меньший объем, ДГК – больший объем) и их этиловыми эфирами обеспечивает разницу в связывании белками-рецепторами с различными объемами сайта связывания лигандов. Например, более объемный этиловый эфир ДГК лучше связывается с бо́льшим сайтом в ферментах ЦОГ-1/2, а этиловый эфир ЭПК с меньшим объемом лучше связывается с меньшим по объему сайтом связывания 5-ЛПОГ. Поэтому препараты, содержащие этиловые эфиры и ЭПК, и ДГК, могут более эффективно взаимодействовать с различными ферментами, чем препараты, содержащие этиловые эфиры только ЭПК или только ДГК.

Большее сродство этиловых эфиров ЭПК и ДГК к молекулам ферментов каскада АРК является одной из фундаментальных основ высокой терапевтической эффективности препаратов ω-3 ПНЖК с высокой степенью стандартизации.

1. www.rcsb.org.