Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), модулируя ноцицепцию и подавляя избыточные болевые реакции посредством регуляции активности каскада арахидоновой кислоты, используются для преодоления болевых синдромов различного генеза [1].

Для поиска и анализа молекул с требуемым мультитаргетным действием in silico необходимы методы прогнозирования свойств молекул исходя из их химической структуры. Фармакологические/биологические свойства молекул могут быть оценены посредством конгломерата методов хемоинформационного анализа, развиваемых в научной школе академиков РАН Ю.И. Журавлёва и К.В. Рудакова под общей рубрикой «хемореактомный анализ» [2]. Результатом его применения является комплексная, разносторонняя оценка фармакологических эффектов действующих начал лекарств (фармакоинформационные спектры, или профили молекул-кандидатов или препаратов) [3–5].

Цель – выявить и оценить наиболее существенные отличия молекулы-кандидата RRS-1 (N-{(Z)-2-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1-[(пропиламино)карбонил]винил}бензамида) от других НПВП посредством дифференциального хемореактомного анализа.

Мимикрия молекул тех или иных действующих начал в контексте метаболом обусловливает желательные и побочные эффекты лекарственных препаратов [6]. Информационная технология хемоинформационного анализа, включающая сопоставление структуры молекулы-запроса с другими известными молекулами посредством топологической теории распознавания [7–9], позволяет оценить количественно и качественно схожесть молекулы с метаболитами и взаимодействия с протеомом. Молекулы, структуры которых были исследованы в настоящей работе, показаны на рисунке 1.

Как и в других наших работах по хемореактомике [1][3][4][8], анализ включал три стадии:

– формирование базы данных для обучения алгоритмов на основе ключевых слов (“nociception”, “dopamine”, “histamine”) и поисков в базе данных PubChem;

– нахождение в базе данных, сформированной на первой стадии, молекул, наиболее близких по структуре к молекулам-запросам (см. рис. 1) посредством расчета химического расстояния (dχ) по теории хемографов [7][8];

– вычисление констант полумаксимального ингибирования (англ. half-maximal inhibitory concentration, IC50) и полумаксимальной эффективной концентрации (англ. half-maximal effective concentration, EC50) белков протеома методами числового прогнозирования [10].

В рамках настоящей серии вычислительных экспериментов на один таргетный белок протеома приходилось в среднем 14 экспериментов.

Результаты хемопротеомного профилирования четырех молекул со свойствами НПВП (RRS-1, диклофенак, нимесулид, кеторолак) на протеоме человека позволили оценить эффекты НПВП на дофаминовые, опиоидные, каннабиноидные, ацетилхолиновые, брадикининовые рецепторы и др.

В рамках хемопротеомного профилирования изучаемых молекул проведен анализ взаимодействий молекул с белками протеома человека. Достоверные отличия в эффектах исследованных молекул были найдены для 1232 белков. Проценты белков протеома со схожим воздействием существенно отличались между молекулами (табл. 1).

На метрической диаграмме (рис. 2) каждому соединению соответствует одна точка, которая, в свою очередь, отражает расстояния 1232-мерного вектора, содержащего взаимодействия соединения с выборкой белков протеома, от всех остальных векторов (точек). Видно, что взаимодействия соединения RRS-1 с выборкой белков протеома существенно отличаются от взаимодействий всех остальных молекул НПВП. При этом RRS-1 расположен правее вдоль обобщенной координаты свойств диклофенака, что соответствует более выраженному противовоспалительному действию молекулы RRS-1.

Из данных таблицы 1 следует, что профиль взаимодействия соединения RRS-1 с протеомом человека более схож с профилями диклофенака (59%) и нимесулида (51%), чем с профилем кеторолака (39%). Дифференциальный анализ результатов хемореактомного моделирования направлен на выявление биологических активностей (таргетных белков протеома человека), которые наиболее выраженно отличают молекулы друг от друга. В соответствии с целями настоящего исследования наиболее важным является нахождение отличий именно молекулы-кандидата RRS-1.

Результаты хемопротеомного моделирования позволили выявить такие различия в оценках взаимодействия исследованных молекул с рецепторами (рис. 3). Полученные оценки целесообразно разделить на три группы: оценки активации белков протеома, оценки ингибирования белков протеома и оценки минимальности вмешательства в активность белков протеома (прежде всего со стороны соединения RRS-1). Если первые две группы относятся к оценке эффективности исследованных молекул как потенциальных терапевтических средств, то третья имеет прямое отношение к безопасности (иными словами, лекарства не должны изменять активность белков, не имеющих отношения к патофизиологии соответствующего заболевания).

Активация белков протеома

Хемореактомный анализ молекул-запросов (см. рис. 1) указал на участие активации аденозиновых, каннабиоидных, дофаминовых рецепторов протеома в противодействии молекулы RRS-1 патофизиологии боли и воспаления. Аденозин характеризуется противовоспалительным и нейропротекторным эффектами. Реализация биологических эффектов аденозина осуществляется посредством аденозиновых рецепторов A1, A2a, A2b и A3, контролирующих состояние сосудов в сердечно-сосудистой и цереброваскулярной системах. Активация A1-рецепторов снижает частоту сердечных сокращений, а активация A2-рецепторов улучшает кровоток и снижает артериальное давление. Сокращение активности аденозина приводит к увеличенной глутаматной нейротрансмиссии. Вещества с анальгетическим действием на мышиной модели хронической нейропатической боли индуцируют антиноцицепцию посредством активации аденозиновых рецепторов типа A2A [11].

Интересно отметить, что у крыс с артритом, вызванным адъювантом Фрейнда, мануальная акупунктура облегчает воспалительную боль именно посредством активации аденозиновых рецепторов [12]. Для аденозинового рецептора типа А2 значение константы активации ЕС50 составило 178 нМ для RRS-1, а для остальных молекул показатели были существенно выше (325–1697 нМ). Для аденозинового рецептора А1 значение ЕС50 составило 183 нМ, для остальных молекул – на порядок выше (3953–9820 нМ).

Каннабиноидный рецептор-2 активируется эндоканнабиноидом 2-арахидоноилглицерином, модулирующим ноцицепцию [13] и тормозящим нейродегенерацию [14]. Молекулы RRS-1 (ЕС50 124 нМ) и кеторолак (ЕС50 156 нМ) могут активировать СВ2 (другие молекулы-запросы: 513–3695 нМ).

Дофаминовый рецептор D2 опосредует анальгетический эффект, вызываемый нисходящим дофаминергическим путем, в модели нейропатической боли при поражении тройничного нерва у мышей. Специфическое возбуждение дофаминергических нейронов в ядре А11 ослабляло нейропатическую боль тройничного нерва за счет активации рецепторов D2 в каудальном ядре тройничного нерва спинного мозга [15]. Из исследованных молекул только для RRS-1 была получена значимая оценка активации D2-рецепторов (ЕС50 49 нМ; остальные молекулы: 3323–9989 нМ). Молекулы RRS-1 и диклофенак могут активировать рецептор гамма-аминомасляной кислоты А (ГАМКА) (ЕС50 86 и 93 нМ; другие молекулы: 192 и 530 нМ), реализующий эффекты основного тормозного нейромедиатора центральной нервной системы.

Ингибирование белков протеома

RRS-1 может ингибировать рецепторы хемокинов типа С-С (CCR1), лейкотриена LTB4, глутамата и другие белки, так или иначе участвующие в воспалении. Дополнительно RRS-1 – потенциальный антагонист киназ, используемых как таргетные белки противоопухолевой фармакотерапии.

Рецепторы хемокинов типа CCR, активируемые хемокинами типа MCP-3/4/RANTES/MIP-1 способствуют воспалению [16]. RRS-1 ингибирует CCR1 (IC50 932 нМ; диклофенак: 2947 нМ; кеторолак: 4044 нМ), CCR3 (IC50 121 нМ; другие молекулы: 345–949 нМ) и CCR8 (IC50 215 нМ; другие молекулы: 674–1508 нМ).

Молекула межклеточной адгезии интегрин альфа-L/бета-2 (ICAM1) – лиганд белка адгезии лейкоцитов интегрин альфа-L/бета-2. Во время трансэндотелиальной миграции лейкоцитов активность ICAM1 способствует этому посредством белок-белковых комплексов ARHGEF26/SGEF/RHOG [17], также приводя к инвазии вирусов внутрь клеток организма-хозяина [18]. RRS-1 ингибировал белок ICAM1 (IC50 578 нМ; другие молекулы: 983–4851 нМ). Ингибируя CSF-1R (IC50 29 нМ; другие молекулы: 99–223 нМ), RRS-1 может способствовать снижению пролиферации макрофагов и моноцитов [19] и тормозить нейродегенерацию [20].

RRS-1 и диклофенак (IC50 100 нМ; другие молекулы: 432 и 992 нМ) ингибировали киназу IRAK4, участвующую в реализации эффектов толл-рецепторов и рецептора интерлейкина-1 [21] посредством транскрипционного ядерного фактора каппа В (англ. nuclear factor kappa B, NF-κB) [21].

RRS-1 может ингибировать матриксные металлопротеиназы (англ. matrix metalloproteinase, MMP), деградирующие коллагено-эластиновую компоненту соединительной ткани сосудов, облегчая инвазию лейкоцитов: MMP8 (IC50 203 нМ; нимесулид: 270 нМ; другие: 950–1000 нМ). Коллагеназа (MMP9), необходимая для протеолиза внеклеточного матрикса, способствует инвазии лейкоцитов (RRS-1: IC50 39 нМ; остальные: 401–2037 нМ). MMP12 также преимущественно ингибируется RRS-1 (IC50 75 нМ; другие: 328–3602 нМ). RRS-1 может ингибировать лейкоцитарную эластазу (IC50 38 нМ), участвующую в патофизиологии воспалительных заболеваний, в т.ч. эмфиземы [22]. Важным аспектом действия RRS-1 может являться ингибирование рецептора LTB4 (IC50 49 нМ; нимесулид: 85 нМ; другие: 1081 и 402 нМ).

Дополнительно были получены оценки возможных эффектов RRS-1 на фактор свертывания крови и на метаботропный глутаматный рецептор 5. Фактор коагуляции крови Х – витамин К-зависимый гликопротеиновый фермент, превращающий протромбин в тромбин (IC50 26 нМ; остальные: 108–867 нМ). Гиперактивность метаботропного рецептора глутамата 5 – фактор патофизиологии ишемии головного мозга, воспаления, ноцицепции [23]. RRS-1 и нисмесулид (IC50 360–380 нМ) ингибировали метаботропный рецептор более, чем диклофенак (IC50 608 нМ) и кеторолак (IC50 2824 нМ).

По данным моделирования белок-лигандных комплексов методологией докинга молекулы RRS-1 может связываться с метаботропным глутаматным рецептором с энергией связывания, в 2 раза большей, чем ранее исследованная молекула SV-1010. Хемореактомное моделирование константы IC50 для метаботропного рецептора глутамата 5 подтвердило, что значение IC50 для RRS-1 существенно ниже (378 нМ), чем для SV-1010 (2320 нМ). Данное различие в значениях констант приблизительно соответствует двукратной разнице в изменении свободной энергии связывания Гиббса.

Рецептор брадикинина 1 связывает брадикинин и другие кининогены, способствуя высвобождению других медиаторов воспаления. Антагонисты рецепторов брадикинина рассматриваются как перспективные средства для лечения острых эпизодов отека и воспаления. RRS-1 и кеторолак ингибировали этот рецептор в большей степени (IC50 24 нМ), чем две другие молекулы (IC50 52–85 нМ).

Ингибирование киназ

Аврора киназа А (AURKА) участвует в регуляции клеточного цикла, требуется для активации циклинзависимой киназы CDK1 [24] и является регуляторным компонентом путей p53/TP53, имеющих решающее значение для онкогенной трансформации клеток. Ингибиторы AURKА – перспективные противоопухолевые лекарства [25]. Из исследованных молекул наилучшим ингибитором AURKA было соединение RRS-1 (IC50 275 нМ; остальные: 548–5084 нМ).

Аврора киназа B (AURKB) играет роль в развитии клеточного цикла, сверхэкспрессия связана с инвазией опухолевых клеток, метастазированием и устойчивостью к лекарствам. Ингибиторы AURKB – также перспективные противоопухолевые средства [26]. Вещество RRS-1 наилучшим образом ингибировало AURKB (IC50 34 нМ; другие молекулы: 150–923 нМ).

Ингибиторы CDK4 исследуются как противоопухолевые препараты [27]. RRS-1 отличался наименьшей константой ингибирования среди изученных молекул (IC50 164 нМ; остальные молекулы: 320–805 нМ). Циклинзависимая киназа CDK9, опосредующая внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов фактора некроза опухоли альфа или интерлейкина-6 через каскады NF-κB/STAT3 [28], также ингибируется веществом RRS-1 и диклофенаком (IC50 221 и 264 нМ) в большей степени, чем нимесулид (IC50 1127 нМ) и кеторолак (IC50 664 нМ). Ингибирование CDK9 способствовало уменьшению потери костной массы пародонта и воспалительной реакции, вызванной бактериями P. gingivalis и приводящей к пародонтиту [29]. Для регуляторной субъединицы CDK9 (реализация эффектов CDK9, транскрипция вирусных генов [30]) значение IC50 для RRS-1 составило 178 нМ, для остальных молекул – 458–1492 нМ.

Серин/треонин-протеинкиназа PLK1 во время М-фазы цикла деления клетки участвует в регуляции созревания центросом, сборке веретена, удалении когезинов из плеч хромосом, инактивации комплекса/циклосомы, способствует активации CDK1 путем фосфорилирования положительного регулятора CDC25C и ингибирования отрицательных регуляторов WEE1 и PKMYT1/MYT1 [31]. RRS-1 ингибировал PLK1-киназу существенно больше (IC50 65 нМ), чем остальные молекулы (отличие на два порядка: 9994–11339 нМ). Провоспалительные серин/треонин-протеинкиназа SRPK2 [32] (RRS-1: IC50 322 нМ; другие молекулы: 9770–9900 нМ) и киназа GSK-3β [33] (RRS-1: IC50 44 нМ; другие молекулы: 85–376 нМ) также ингибировались RRS-1.

Минимальность вмешательства в активность белков протеома

Как было отмечено выше, минимизация вмешательства молекул-кандидатов в активность очевидно нетаргетных белков соответствует минимизации побочных эффектов исследуемых молекул. С этой точки зрения чем слабее взаимодействия молекулы RRS-1 с различными гормональными рецепторами (кальциферола, тиреоидных гормонов, ацетилхолина, орексина и др.), тем выше безопасность лекарства.

Рецептор витамина D3 (VDR) реализует эффекты кальцитриола (активной формы витамина) посредством прямого воздействия на транскрипцию тысяч генов. Ингибирование VDR нежелательно, т.к. приводит к функциональному дефициту витамина [34]. RRS-1 оказывал наименьшее влияние на активность VDR (521 нМ; остальные молекулы: 53–220 нМ).

Бета-рецептор гормона щитовидной железы действует как репрессор или активатор транскрипции генов. Рецептор характеризуется высоким сродством к гормонам щитовидной железы, включая трийодтиронин и тироксин [35]. RRS-1 практически не влиял на активность этого рецептора (4757 нМ).

Вмешательство со стороны противовоспалительных средств в ацетилхолиновую нейротрансмиссию (особенно ингибирование, в т.ч. рецептора α/β/δ/γ AChR1 [36]) крайне нежелательно. RRS-1 практически не влиял на активность рецептора AChR1 (8265 нМ), а также рецептора CHRNA3 (7616 нМ; остальные молекулы: 1543–2590 нМ).

Каннабиноидный рецептор CNR1, связанный с G-белком, необходим для эндогенных каннабиноидов анандамида и 2-арахидоноилглицерина [37]. Он опосредует многие эффекты, вызванные каннабиноидами, влияя среди прочего на прием пищи, моторику желудочно-кишечного тракта, потерю памяти, каталепсию, подвижность, тревогу, хроническую боль, усиливая дыхание при низких дозах и угнетая при высоких [37]. Воздействие обезболивающих средств на CNR1 никак не может быть ингибирующим. По результатам хемореактомного анализа RRS-1 практически не влиял на активность (3739 нМ; другие молекулы: 219–537 нМ). Хемореактомный анализ показал минимальность воздействия RRS-1 на ноцицептивный опиоидный рецептор дельта [38] (286 нМ; остальные молекулы: 64–130 нМ) и рецепторов орексинов [39], влияющих на цикл сна-бодрствования и уровни гистамина в центральной нервной системе (1232 нМ; остальные молекулы: 199–220 нМ).

Рецептор активаторов пролиферации пероксисом гамма (PPARG) связывает пролифераторы пероксисом (особые жирные кислоты или гиполипидемические препараты), модулируя затем транскрипцию своих генов-мишеней, в пероксисомальном бета-окислении жирных кислот и воспалении через каскад NF-κB [40]. Среди исследованных молекул RRS-1 в наименьшей степени влиял на PPARG (1329 нМ; нимесулид: 136 нМ).

Также для исследованных молекул были получены оценки взаимодействий с различными метаболическими ферментами. Например, 17β-гидроксистероиддегидрогеназа-3 необходима для восстановления андростендиона до тестостерона с использованием кофермента никотинамидадениндинуклеотидфосфат (витамин РР) [41]. RRS-1 слабо вмешивался в активность данного фермента (1437 нМ; другие молекулы: 95–280 нМ).

Эстрадиол-17β-дегидрогеназа-1 способствует снижению уровня эстрогенов и андрогенов с использованием кофермента никотинамидадениндифосфат (витамин РР). RRS-1 наименьшим образом влиял на активность фермента (2177 нМ; другие молекулы: 49–1000 нМ).

Цитохром P450 11B1 (CYP11B1) проявляет стероидную 11β-гидроксилазную активность, осуществляя 18/19-гидроксилирование стероидов и ароматизацию андростендиона в эстрон. Вмешательство в активность этого фермента очевидным образом приведет к нарушению баланса андрогенов и эстрогенов. RRS-1 влиял на активность CYP11B1 гораздо слабее (747 нМ; другие молекулы: 127–218 нМ). RRS-1 также не влиял на активность карбоксипептидазы CPB2 (деактивирует кинины [42] (6985 нМ; другие молекулы: 1600–2700 нМ) и фарнезилдифосфатсинтазы – ключевого фермента биосинтеза изопреноидов (160 нМ; остальные молекулы: 20–100 нМ). RRS-1 слабо влияет на белок связывания жирных кислот FABP3 (3807 нМ; другие молекулы: 450–1190 нМ) и белок активации фибробластов [43] (8193 нМ; другие молекулы: 1133–4100 нМ).

Нейрональная синтаза оксида азота (NO) вырабатывает NO в мозге и является молекулой-мессенджером, выполняющей разнообразные функции. В мозге и периферической нервной системе NO проявляет многие свойства нейромедиатора, также опосредует посттрансляционную модификацию (S-нитрозилирование цистеина). Активность нейрональной NO-синтазы практически не затрагивалась RRS-1 (11 577 нМ), в отличие, например, от диклофенака (493 нМ).

Важно, что молекула-кандидат RRS-1 слабо взаимодействует с рядом протеинкиназ – центральных сигнальных белков любой клетки, участвующих в регуляции пролиферации, апоптоза, дифференцировки, миграции и адгезии клеток [44]. Протеинкиназа С-альфа: RRS-1 и нимесулид (480–500 нМ) в меньшей степени воздействовали на активность киназы, чем две другие молекулы (40 и 124 нМ). Протеинкиназа C-эта [45]: RRS-1 практически не влиял (6667 нМ; другие молекулы: 88–574 нМ). Протеинкиназа С-гамма модулирует активность опиоидных рецепторов мю-типа, участвуя в сигнальном пути, который приводит к фосфорилированию и деградации опиоидных рецепторов, и может также способствовать хроническим изменениям опиоидной ноцицепции [46]. Нарушение активности такого важного сигнального белка приведет к дисбалансу регуляции ноцицепции. RRS-1 вмешивался наименьшим образом (612 нМ), в отличие, например, от диклофенака (86 нМ).

Описанное выше модулирование активности таргетных белков протеома человека соответствует снижению интенсивности ноцицептивных сигналов, а слабое вмешательство НПВП в адренергическую и другие нейротрансмиттерные системы соответствует снижению центральных побочных эффектов. Хемореактомное моделирование (табл. 2) подтвердило эффекты молекул на протеоме человека (вообще говоря, in vitro) с точки зрения экспериментальных исследований изученных молекул у мышей (in vivo).

Хемореактомное моделирование результатов экспериментальных исследований изученных молекул у мышей показало, что в тесте антиноцицептивной активности на корчах, вызванных уксусной кислотой, значение ED50 было наименьшим для RRS-1 (0,159 мг/кг) и кеторолака (0,16 мг/кг), чем у других молекул (0,9–1,0 мг/кг). Схожие результаты получены для RRS-1 для антиноцицептивной активности с помощью теста на судороги брюшной полости, вызванные ацетилхолином (ED50 0,22 мг/кг; другие молекулы: 0,26–0,57 мг/кг), на тепловой модели боли (ED50 0,40 мг/кг; другие молекулы: 0,48–0,60 мг/кг) и в модели с уксусной кислотой (ED50 48%; другие молекулы: 23,38%).

Еще одним аспектом безопасности молекул-кандидатов является их влияние на обмен витаминов и минералов – ключевых регуляторов метаболизма клеток и тканей. Патофизиология самых различных заболеваний включает ятрогенные эффекты ряда лекарств, в т.ч. стимулирование ими интенсивных потерь витаминов и микроэлементов (минералов). Фармакоинформационные профили исследуемых соединений указали на существенные различия в их антивитаминном действии (рис. 4).

Наиболее выраженным антимикронутриентным действием характеризовался диклофенак, который может стимулировать выведение цинка, калия, магния, витаминов группы В (биотина, В1, В2, В6, фолатов), витаминов С и D. Вещество RRS-1 отличалось умеренным профилем антивитаминного действия: суммарный балл потери витаминов и минералов (7,4±3,7) был существенно меньше, чем в случае диклофенака (11,7±4,5) и фактически был на одном уровне с нимесулидом (6,9±3,7) и кеторолаком (6,7±3,6).

Суммарный балл RRS-1 по всем витаминам и минералам составил 7,4, что соответствует в среднем увеличению риска выведения того или иного микронутриента приблизительно на 35%. В наименьшей степени RRS-1 может стимулировать потери Ca2+, Zn2+ из эритроцитов, витаминов B12, Е, К. Он может умеренно усиливать потери Li+, Fe2+, Zn2+ из цельной крови, витаминов D3, B6, С из сыворотки. Соответственно, дополнение терапии RRS-1 перечисленными микронутриентами в физиологических дозах снизит риск их потерь практически до нуля.

Хемопротеомное моделирование фармакологических эффектов перспективной молекулы RRS-1 в сравнении с известными НПВП (диклофенак, нимесулид, кеторолак) на протеоме человека показало достоверные отличия в эффектах взаимодействий с 1232 белками протеома. Результаты позволили выявить 47 таргетных белков, которые наиболее выраженно отличают эффекты молекулы RRS-1 от всех остальных. RRS-1 способен:

– активировать рецепторы аденозина, дофамина, каннабиноидов, ГАМК, внося вклад в противовоспалительный, антиноцицептивный, нейропротекторный эффекты;

– ингибировать провоспалительные таргетные белки (CCR1, CCR3, CCR8, рецепторы LTB4, колониестимулирующий фактор макрофагов);

– ингибировать ряд киназ – таргетов противоопухолевой и противовоспалительной терапии (AURKA, AURKB, CDK4, CDK9, PLK1, SRPK2, GSK3B).

Вещество RRS-1 отличается умеренным профилем антивитаминного действия и не вмешивается в активность исследованных гормональных рецепторов (кальциферола, тиреоидных гормонов и др.).

Таким образом, хемопротеомное и хемореактомное профилирование молекулы-кандидата RRS-1 указывает на дополнительные молекулярно-фармакологические свойства, в меньшей степени выраженные у молекул сравнения. Эти свойства могут способствовать усилению противоболевых эффектов соединения у определенных групп пациентов.